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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 原核表达蛋白量很低
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qianbudiaoa

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达蛋白量很低已有6人参与

原核表达融合蛋白量很低,不知道是什么原因.尝试过很多优化表达条件的方法都不行,不知道是不是存在其他表达量低的原因,求指教.
先简单介绍下我表达的信息吧：载体是pet—28a（+），表达菌株为BL21 ，没有信号肽序列，蛋白为包涵体形式存在于沉淀中，带有his标签，

再介绍下我表达的方法：提前一晚摇菌，第二天转接，到OD0.8 时加入IPTG诱导过夜，离心后倒掉上清，pbs悬浮沉淀后-80度冰箱冻存一夜，第二天加溶菌酶孵化2小时，超声破碎，离心后沉淀用wash buffer洗涤后离心，得到的沉淀重悬于2M尿素的PBS中，-20度冻存2~3h，然后跑SDSPAGE电泳，结果是蛋白表达量很低。

以下说说我做过的尝试:不同温度诱导,37度,30度,25度都做过,37度完全没有表达,30度和25度表达量很低而且差不多.
                                    不同IPTG浓度诱导，0，50，100，200，300，400mM /ml  浓度梯度25度诱导过夜，都有表达但是表达量都很低而且没有明显差异。
                                    诱导时间，4h，8h，12h，16h，24h都做过，表达量还是都很低，也看不出来时间不够还是时间太长蛋白降解了。
                                   还有一个转速的问题，只用过250rpm，不知道降低转速会不会有影响，打算下个星期尝试一下。
实在是不知道为什么表达量很低了，问了身边的很多人，方法都尝试过了，还是没有进展，求做过类似实验，遇到过类似问题的能给我指导一下，不胜感激。
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1楼2014-03-16 16:51:47
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我要吃西瓜

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by woolley at 2014-03-17 10:30:43
在不更换载体的表达菌株的情况下，看你已经优化了表达温度，IPTG浓度等
还可以优化的有：
1. 提高诱导的OD，看你是包涵体表达，所以可以尝试OD1.0 或者1.2进行诱导
2. 优化培养基，一个是采用富营养培养基，如TB ...

为什么是提高OD值呢？不是应该在0.4~0.6左右的对数期加入诱导剂会好一些吗？求解。。
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9楼2014-04-03 13:24:56
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c_jade

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lzj686876 at 2014-03-18 11:07:18
我的也是如此，不过OD为0.9时加了0.1mMIPTG，37度5小时OD还没达到1.5，怎么回事呢，谢谢！...

有没有设空白对照
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8楼2014-03-18 14:15:02
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sabbas

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

1.蛋白表达可能对细胞有毒性，表达后被细胞快速降解掉。尤其是加了IPTG后发现细胞生长很慢，可能是这个原因。
这种情况可以尝试在高OD诱导，37度做短时间表达 （1-3小时）。 前面有人提到的用TB这种高营养培养基，也可能有帮助。
2.可以尝试copy number 比较高的vector进行表达，比如pRSFDuet。也可能会有帮助。也需要关注可溶部分，有时蛋白部分可溶，部分在inclusion body。
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10楼2014-04-03 21:31:13
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普通回帖

句号123

新虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
2楼2014-03-16 21:49:24
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2, 感谢经验分享 2014-03-18 17:15:24
在不更换载体的表达菌株的情况下，看你已经优化了表达温度，IPTG浓度等
还可以优化的有：
1. 提高诱导的OD，看你是包涵体表达，所以可以尝试OD1.0 或者1.2进行诱导
2. 优化培养基，一个是采用富营养培养基，如TB(Terrific Broth)等，另一个是更换培养基的碳源，向培养基中加入甘油等
3. 还有就是你有没有分析过蛋白的编码序列，是不是稀有密码子过多？如果稀有密码子多的话，可以更换表达菌株，变为Rosseta，或者进行密码子优化（点突变或者全基因合成）
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3楼2014-03-17 10:30:43
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wh6125

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也遇到了同样的问题，也是很低，尝试了各种温度、时间、浓度，没有变化。师姐的建议是换载体，但是没有其他载体，打算继续往下做着试试，还没有尝试。楼主何时解决了交流一下
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4楼2014-03-17 13:36:27
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c_jade

新虫 (初入文坛)
菌体生长正常吗？OD值
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5楼2014-03-17 16:02:21
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小小的尾巴

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我的也是，很低，超声之后包涵体里浓度还达不到20%，纯化之后更惨，也是各种优化条件，表达量几乎不变
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6楼2014-03-18 09:11:12
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lzj686876

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by c_jade at 2014-03-17 16:02:21
菌体生长正常吗？OD值

我的也是如此，不过OD为0.9时加了0.1mMIPTG，37度5小时OD还没达到1.5，怎么回事呢，谢谢！
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7楼2014-03-18 11:07:18
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