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原核表达蛋白量很低 已有6人参与
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原核表达融合蛋白量很低,不知道是什么原因.尝试过很多优化表达条件的方法都不行,不知道是不是存在其他表达量低的原因,求指教. 先简单介绍下我表达的信息吧：载体是pet—28a（+），表达菌株为BL21 ，没有信号肽序列，蛋白为包涵体形式存在于沉淀中，带有his标签， 再介绍下我表达的方法：提前一晚摇菌，第二天转接，到OD0.8 时加入IPTG诱导过夜，离心后倒掉上清，pbs悬浮沉淀后-80度冰箱冻存一夜，第二天加溶菌酶孵化2小时，超声破碎，离心后沉淀用wash buffer洗涤后离心，得到的沉淀重悬于2M尿素的PBS中，-20度冻存2~3h，然后跑SDSPAGE电泳，结果是蛋白表达量很低。 以下说说我做过的尝试:不同温度诱导,37度,30度,25度都做过,37度完全没有表达,30度和25度表达量很低而且差不多. 不同IPTG浓度诱导，0，50，100，200，300，400mM /ml 浓度梯度25度诱导过夜，都有表达但是表达量都很低而且没有明显差异。 诱导时间，4h，8h，12h，16h，24h都做过，表达量还是都很低，也看不出来时间不够还是时间太长蛋白降解了。 还有一个转速的问题，只用过250rpm，不知道降低转速会不会有影响，打算下个星期尝试一下。 实在是不知道为什么表达量很低了，问了身边的很多人，方法都尝试过了，还是没有进展，求做过类似实验，遇到过类似问题的能给我指导一下，不胜感激。 |
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 核酸生物学实验经验 | 蛋白表达纯化鉴定精华 |
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8楼2014-03-18 14:15:02
10楼2014-04-03 21:31:13
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2楼2014-03-16 21:49:24
【答案】应助回帖
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youlinglyw: 金币+2, 感谢经验分享 2014-03-18 17:15:24
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在不更换载体的表达菌株的情况下，看你已经优化了表达温度，IPTG浓度等 还可以优化的有： 1. 提高诱导的OD，看你是包涵体表达，所以可以尝试OD1.0 或者1.2进行诱导 2. 优化培养基，一个是采用富营养培养基，如TB(Terrific Broth)等，另一个是更换培养基的碳源，向培养基中加入甘油等 3. 还有就是你有没有分析过蛋白的编码序列，是不是稀有密码子过多？如果稀有密码子多的话，可以更换表达菌株，变为Rosseta，或者进行密码子优化（点突变或者全基因合成） |
3楼2014-03-17 10:30:43
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lzj686876
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7楼2014-03-18 11:07:18
