| 查看: 3150 | 回复: 13 | |||||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者qianbudiaoa将赠送您 6 个金币 | |||||
[求助]
原核表达蛋白量很低已有6人参与
|
|||||
|
原核表达融合蛋白量很低,不知道是什么原因.尝试过很多优化表达条件的方法都不行,不知道是不是存在其他表达量低的原因,求指教. 先简单介绍下我表达的信息吧：载体是pet—28a（+），表达菌株为BL21 ，没有信号肽序列，蛋白为包涵体形式存在于沉淀中，带有his标签， 再介绍下我表达的方法：提前一晚摇菌，第二天转接，到OD0.8 时加入IPTG诱导过夜，离心后倒掉上清，pbs悬浮沉淀后-80度冰箱冻存一夜，第二天加溶菌酶孵化2小时，超声破碎，离心后沉淀用wash buffer洗涤后离心，得到的沉淀重悬于2M尿素的PBS中，-20度冻存2~3h，然后跑SDSPAGE电泳，结果是蛋白表达量很低。 以下说说我做过的尝试:不同温度诱导,37度,30度,25度都做过,37度完全没有表达,30度和25度表达量很低而且差不多. 不同IPTG浓度诱导，0，50，100，200，300，400mM /ml 浓度梯度25度诱导过夜，都有表达但是表达量都很低而且没有明显差异。 诱导时间，4h，8h，12h，16h，24h都做过，表达量还是都很低，也看不出来时间不够还是时间太长蛋白降解了。 还有一个转速的问题，只用过250rpm，不知道降低转速会不会有影响，打算下个星期尝试一下。 实在是不知道为什么表达量很低了，问了身边的很多人，方法都尝试过了，还是没有进展，求做过类似实验，遇到过类似问题的能给我指导一下，不胜感激。 |
回复此楼» 收录本帖的淘贴专辑推荐
 核酸生物学实验经验 | 蛋白表达纯化鉴定精华 |
» 猜你喜欢
请问有知道博士后面上专家评审什么时候结束的么？
已经有10人回复
-
夏至，要不要硕博联谊
已经有10人回复
-
今年什么时候会评啊
已经有9人回复
-
大佬们，打的核磁氢谱与chemdraw预测的有偏差
已经有7人回复
-
为何全世界都用JCR分区，咱们要弄个中科院分区？意义何在？
已经有4人回复
-
offer选择
已经有10人回复
-
论文被硕导卡
已经有6人回复
-
三颈瓶加热
已经有5人回复
-
请问三个字的中文名字，在文中到底怎么表示？
已经有7人回复
-
高校辞职，要求赔偿，这到底合不合理
已经有36人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 做了原核表达，表达量很低，求助~~
已经有16人回复
- 求助：两种蛋白融合原核表达的问题
已经有15人回复
- 低温诱导蛋白表达时用多少度合适？
已经有16人回复
- 目的蛋白表达量低
已经有4人回复
- 原核表达蛋白纯化
已经有32人回复
- 原核表达蛋白复性的具体方案
已经有14人回复
- 蛋白分子量的表示
已经有10人回复
- 原核表达诱导蛋白
已经有7人回复
- 蛋白分子量大小与它的表达量相关吗？
已经有4人回复
- 大量培养 诱导 蛋白没有差异表达
已经有11人回复
- 原核表达分子量问题
已经有9人回复
- 蛋白表达分子量偏大
已经有25人回复
- 原核表达和SDS-PAGE
已经有9人回复
- 蛋白的表达量低不稳定怎么办
已经有11人回复
- 关于Pet28a载体构建的质粒，蛋白表达量低是怎么回事。请大家帮忙
已经有8人回复
- 原核表达蛋白分子量大小
已经有13人回复
- 蛋白表达诱导剂的选择
已经有3人回复
- 蛋白表达量的提高
已经有24人回复
- 【资料】studier的自动诱导系统---原核诱导表达蛋白，无需IPTG
已经有125人回复
- pET-28a原核不能表达目的蛋白
已经有17人回复
- 原核表达 PET-30载体 目的蛋白分子量偏小？
已经有18人回复
- 关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白
已经有16人回复
- 原核表达中SDS-PAGE上样量如何确定？
已经有7人回复
- 蛋白表达量少 怎么办
已经有11人回复
- 【求助/交流】原核表达蛋白分子量偏大
已经有17人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌中蛋白表达量偏低，大家有什么建议？
已经有28人回复
- 【求助/交流】蛋白诱导表达不出目标条带
已经有41人回复
- 【求助/交流】原核表达蛋白大小的问题。
已经有8人回复
9楼2014-04-03 13:24:56
8楼2014-03-18 14:15:02
10楼2014-04-03 21:31:13
|
本帖内容被屏蔽 |
2楼2014-03-16 21:49:24
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2, 感谢经验分享 2014-03-18 17:15:24
感谢参与，应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2, 感谢经验分享 2014-03-18 17:15:24
|
在不更换载体的表达菌株的情况下，看你已经优化了表达温度，IPTG浓度等 还可以优化的有： 1. 提高诱导的OD，看你是包涵体表达，所以可以尝试OD1.0 或者1.2进行诱导 2. 优化培养基，一个是采用富营养培养基，如TB(Terrific Broth)等，另一个是更换培养基的碳源，向培养基中加入甘油等 3. 还有就是你有没有分析过蛋白的编码序列，是不是稀有密码子过多？如果稀有密码子多的话，可以更换表达菌株，变为Rosseta，或者进行密码子优化（点突变或者全基因合成） |
3楼2014-03-17 10:30:43
4楼2014-03-17 13:36:27
5楼2014-03-17 16:02:21
6楼2014-03-18 09:11:12
lzj686876
金虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 434.2
- 散金: 2
- 帖子: 250
- 在线: 44.9小时
- 虫号: 2008712
- 注册: 2012-09-17
- 性别: GG
- 专业: 生物化工与食品化工
7楼2014-03-18 11:07:18
5