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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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543608268

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】BL21表达 已有1人参与

求助 BL21表达时有包涵体 怎么办？
  IPTG浓度最低要求为多少 ？
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1楼 2010-09-07 13:15:27
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evan1987

铜虫 (小有名气)
★ ★
silicare(金币+2):谢谢参与 2010-09-07 16:57:36
543608268(金币+2): 2010-09-07 19:39:04
大肠杆菌表达很多情况下都会是包涵体。想要增加可溶性表达，可以试试低温以及低的IPTG浓度，可以做个梯度分析一下。以前做过0.1—1mM的诱导浓度。如果还不行，换个菌种比如origami试试。或者可以做变复性。
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2楼2010-09-07 13:51:16
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yunwalking

金虫 (小有名气)
★
silicare(金币+1):有时候只能这样了~ 2010-09-07 16:58:00
引用回帖:
Originally posted by 543608268 at 2010-09-07 13:15:27:
求助 BL21表达时有包涵体 怎么办？
  IPTG浓度最低要求为多少 ？

按包涵体做呗  就是 麻烦些罢了
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爱我中华~
3楼2010-09-07 14:27:48
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wchuangqi

铜虫 (小有名气)
可以考虑换宿主
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天道酬勤
4楼2010-09-07 17:03:22
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jia1012428

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
lstt09nk(金币+3):不错~ 2010-09-08 09:12:28
在大肠杆菌中，当外源蛋白高水平表达的时候，极易形成包涵体，为蛋白纯化等下游工作带来很大的麻烦。
下面是一些可以参考的有助于提高目的蛋白可溶性表达的实验方案：
1.降低蛋白合成的速度。可以通过以下方法实现：
    a.降低培养温度
    b.使用弱启动子
    c.使用低拷贝数的质粒表达载体
    d.降低诱导物的浓度
2.改变培养基。
    a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子
    b.加入缓冲液保持pH稳定
    c.加入1%的葡萄糖，抑制lac启动子
    d.加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子
    e.加入乙醇， thiols and disulfides等
3.与分子伴侣或折叠酶共表达。
    常用的分子伴侣有：
    GroES-GroEL
    DnaK-DnaJ-GrpE
    ClpB
    常用的折叠酶有：
    peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPI's)
    disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC)
    protein disulfide isomerase (PDI)
4.分泌表达。使目的蛋白分泌到周质空间。
    周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成，而胞内则是还原性的。
    周质空间有折叠酶DsbA和DsbC的存在，帮助蛋白正确折叠。
    周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解。
    可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。
5.使用特定的菌株。
    AD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB).
    Origami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor).
6.与可溶性partner融合表达。
7.表达目的蛋白的一个片段。> 70 kDa的蛋白在大肠杆菌中是很难表达的。
8.体外去折叠，重新折叠。
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5楼2010-09-07 20:13:51
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