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543608268金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】BL21表达 已有1人参与
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求助 BL21表达时有包涵体 怎么办？ IPTG浓度最低要求为多少 ？ |
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jia1012428
铜虫 (小有名气)
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lstt09nk(金币+3):不错~ 2010-09-08 09:12:28
lstt09nk(金币+3):不错~ 2010-09-08 09:12:28
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在大肠杆菌中，当外源蛋白高水平表达的时候，极易形成包涵体，为蛋白纯化等下游工作带来很大的麻烦。 下面是一些可以参考的有助于提高目的蛋白可溶性表达的实验方案： 1.降低蛋白合成的速度。可以通过以下方法实现： a.降低培养温度 b.使用弱启动子 c.使用低拷贝数的质粒表达载体 d.降低诱导物的浓度 2.改变培养基。 a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子 b.加入缓冲液保持pH稳定 c.加入1%的葡萄糖，抑制lac启动子 d.加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子 e.加入乙醇， thiols and disulfides等 3.与分子伴侣或折叠酶共表达。 常用的分子伴侣有： GroES-GroEL DnaK-DnaJ-GrpE ClpB 常用的折叠酶有： peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPI's) disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC) protein disulfide isomerase (PDI) 4.分泌表达。使目的蛋白分泌到周质空间。 周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成，而胞内则是还原性的。 周质空间有折叠酶DsbA和DsbC的存在，帮助蛋白正确折叠。 周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解。 可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。 5.使用特定的菌株。 AD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB). Origami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor). 6.与可溶性partner融合表达。 7.表达目的蛋白的一个片段。> 70 kDa的蛋白在大肠杆菌中是很难表达的。 8.体外去折叠，重新折叠。 |
5楼2010-09-07 20:13:51
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3楼2010-09-07 14:27:48
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