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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » BL21(DE3)表达脂肪酶重组质粒，将菌体颜色偏白是是怎么回事
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

[交流] BL21(DE3)表达脂肪酶重组质粒，将菌体颜色偏白是是怎么回事 已有4人参与

最近构建了两个脂肪酶重组质粒，分别转入BL21(DE3)中表达，诱导前菌体颜色一样，加入终浓度0.1mM IPTG 15℃诱导24h后，离心菌体，其中一个的菌体颜色为正常的大肠杆菌色（颜色略偏淡黄些），而另一个菌体就偏白色了，破碎后不是那种呈澄清状，而是有点呈乳白色，离心后沉淀比另一个多。这个质粒已经这样摇过好几次了，结果都是一样，这次是重新连接后再转了一次新买的BL21。两只里同源性很高，跑过蛋白电泳，可溶性蛋白量差不多的。另外也排除染菌的可能了。请各位高手分析下什么原因。谢谢
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1楼 2011-06-29 14:21:18
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bmby

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5楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2011-07-21 15:28:13:
我的脂肪酶基因都是来自环境土壤宏基因组中的，现在它的酶学性质快表征完了，有一些独特的性质。

从环境土壤宏基因组中克隆的话，是先建文库筛选吗？
你是怎样设计克隆引物的？
最近也在做这个，希望能向你学习下。
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7楼2011-11-04 17:49:34
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8楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2011-11-04 21:49:38:
我是先建Fosmid文库，然后直接功能筛选获得阳性克隆，这样直接获得全长基因。
不知你所说的设计克隆引物是指什么？，是获得全长基因后设计全长基因两端的引物还是根据全长基因设计中间部分片段的引物？

是说设计全长基因两端的引物。
你应该是先测序，再根据序列设计引物吗？
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9楼2011-11-05 09:14:33
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bmby

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10楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2011-11-05 09:59:45:
是的，先测序后再设计全长引物，在引物两端加上酶切位点，扩增出我的目的基因后，然后去连接其他载体进行表达

扩增的基因如果和你测序序列不一样，需要突变回去吗？
你用的什么载体？可溶性蛋白量大吗？酶活呢？
大肠杆菌表达会形成难溶的蛋白或者无活性的包涵体，怎样避免这种问题？
是将脂肪酶基因突变改造一下吗，还是去除一些序列或加上一些辅助表达因子？
还有是不是来源于细菌的脂肪酶在大肠杆菌里比较容易分泌出来，而真核微生物脂肪酶在大肠杆菌里表达就特别容易形成包涵体？

我问题很多。。。
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11楼2011-11-05 12:36:39
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12楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2011-11-05 13:48:53:
你扩增基因的时候用高保真性好的酶几乎是不会突变的。我用PET21a表达的，BL21DE3，蛋白可溶性很大，还可以胞外分泌，酶活也很高的。其实与酶的本身性质关系比较大，有的很好表达，有的就很难表达，我有很多条与我 ...

所以说在设计时可以尽量选择最佳方法，但到底可溶不可溶最终还是要看具体表达情况啊。
谢谢楼主！
以后有问题了再来讨教！
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13楼2011-11-07 10:14:55
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14楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2011-11-07 10:42:27:
祝实验顺利

楼主在吗？
克隆出来的基因，怎样认定它是一个新型脂肪酶基因？
NCBI中无序列、没相关文章发表的可以肯定是新的，但是比对有80%左右的相似性可以认为是新的吗？或者说有没有具体的数值指标？
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15楼2011-12-19 10:16:11
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10楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2011-11-05 09:59:45:
是的，先测序后再设计全长引物，在引物两端加上酶切位点，扩增出我的目的基因后，然后去连接其他载体进行表达

楼主，我的实验又出状况了

我设计的引物以宏基因组DNA为模板扩增时得不到想要的序列。。
有其他较短的序列可以扩出，而且量很大，试过退火温度梯度，但是我的目的序列一直未出现。

紧急求助！！
我已经被卡两个星期了！
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17楼2011-12-31 12:28:52
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