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龙开聪

金虫 (小有名气)


[交流] 十万火急,重组质粒酶切只有一条带,测序有结果,但反复说我质粒浓度很低

我使用的载体是Pet-32a(+),宿主菌是BL21(DE3),连接上目的基因后,提取重组质粒进行双酶切,30微升体系,酶切能看到两个条带,但目的基因被切下的条带很淡很淡,送出去测序,结果正确,但发送的报告反复说我质粒浓度很低,我进行表达后,确实表达量很不理想,用改目的基因连接到pcDNA3.1(+)上后,转化JM109,重新提取质粒,酶切使用了30微升体系,只看到载体的条带,使用了60微升体系后,目的基因的条带任然非常淡,近乎看不见,送重组菌出去测序,正反两个方向测序,却只有正一个方向有结果,表明我目的基因是连接上去了,但另一个方向测序却无结果,报告说质粒浓度太低,目的基因片段1100,测序公司为北京诺赛。求高手指点迷津,为何我质粒浓度这么低,导致酶切看不见双条带,原核表达量极低?
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龙开聪

金虫 (小有名气)


送鲜花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by desheng101 at 2012-04-11 21:29:05:
看楼主哭的这么伤心,赶紧来大虾帮帮楼主吧,我是来打酱油的,楼主别建议

做实验真痛苦啊,真羡慕文科生
11楼2012-04-12 17:10:19
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
lz诱导表达的条件可以考虑修改一下~

葡萄糖是不是会一直pet系列载体的表达呢?
2楼2012-04-10 08:43:23
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龙开聪

金虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-10 08:43:23:
lz诱导表达的条件可以考虑修改一下~

葡萄糖是不是会一直pet系列载体的表达呢?

我用50ml诱导表达 没有目的条带,没办法,加到500ML才看到目的条带,体积太大,我不好优化,关键我觉得可能是我质粒浓度低,所以表达量极低,不知如何解决啊
3楼2012-04-10 08:55:36
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龙开聪

金虫 (小有名气)


我想在LB平板上加葡萄糖试试,但不知道LB平板是不是只加葡萄糖,那加不加氨苄呢,还是一起加?
4楼2012-04-10 08:57:18
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