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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低
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龙开聪

金虫 (小有名气)

[交流] 十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低

我使用的载体是Pet-32a（+），宿主菌是BL21(DE3)，连接上目的基因后，提取重组质粒进行双酶切，30微升体系，酶切能看到两个条带，但目的基因被切下的条带很淡很淡，送出去测序，结果正确，但发送的报告反复说我质粒浓度很低，我进行表达后，确实表达量很不理想，用改目的基因连接到pcDNA3.1(+)上后，转化JM109，重新提取质粒，酶切使用了30微升体系，只看到载体的条带，使用了60微升体系后，目的基因的条带任然非常淡，近乎看不见，送重组菌出去测序，正反两个方向测序，却只有正一个方向有结果，表明我目的基因是连接上去了，但另一个方向测序却无结果，报告说质粒浓度太低，目的基因片段1100，测序公司为北京诺赛。求高手指点迷津，为何我质粒浓度这么低，导致酶切看不见双条带，原核表达量极低？
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1楼2012-04-10 08:20:47
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龙开聪

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-10 08:43:23:
lz诱导表达的条件可以考虑修改一下~

葡萄糖是不是会一直pet系列载体的表达呢？

我用50ml诱导表达 没有目的条带，没办法，加到500ML才看到目的条带，体积太大，我不好优化，关键我觉得可能是我质粒浓度低，所以表达量极低，不知如何解决啊
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3楼2012-04-10 08:55:36
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
lz诱导表达的条件可以考虑修改一下~

葡萄糖是不是会一直pet系列载体的表达呢？
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2楼2012-04-10 08:43:23
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龙开聪

金虫 (小有名气)
我想在LB平板上加葡萄糖试试，但不知道LB平板是不是只加葡萄糖，那加不加氨苄呢，还是一起加？
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4楼2012-04-10 08:57:18
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
龙开聪: 金币+7, 谢谢，这两天做实验去了，都没空登陆论坛，建议不错，受益不浅 2012-04-12 17:03:32
看来LZ很纠结这个质粒浓度低，呵呵！
1）从你表述的来看，片段是连上了pET32了，测序结果也是正确的，酶切条带的亮弱直接与你提取的质粒浓度有关系，好像与酶切体系没多大关系。
2）试验中我也感觉pET系列载体copy数确实不太高，好像是中等拷贝吧，只好加大提取质粒的菌量了，从而提高质粒的浓度。
3）另外你用的BL21(DE3)是表达蛋白的宿主菌，如果你换用克隆表达宿主菌XL-1 blue或DH5a来提取质粒也许量就会多一些了。
祝实验顺利！

[ Last edited by srlee on 2012-4-11 at 12:49 ]
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5楼2012-04-10 22:17:34
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