| 查看: 4116 | 回复: 16 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低
|
|||
 我使用的载体是Pet-32a（+），宿主菌是BL21(DE3)，连接上目的基因后，提取重组质粒进行双酶切，30微升体系，酶切能看到两个条带，但目的基因被切下的条带很淡很淡，送出去测序，结果正确，但发送的报告反复说我质粒浓度很低，我进行表达后，确实表达量很不理想，用改目的基因连接到pcDNA3.1(+)上后，转化JM109，重新提取质粒，酶切使用了30微升体系，只看到载体的条带，使用了60微升体系后，目的基因的条带任然非常淡，近乎看不见，送重组菌出去测序，正反两个方向测序，却只有正一个方向有结果，表明我目的基因是连接上去了，但另一个方向测序却无结果，报告说质粒浓度太低，目的基因片段1100，测序公司为北京诺赛。求高手指点迷津，为何我质粒浓度这么低，导致酶切看不见双条带，原核表达量极低？ |
回复此楼» 猜你喜欢
材料专硕英一数二306
已经有6人回复
-
265求调剂
已经有4人回复
-
265求调剂
已经有7人回复
-
26调剂/材料/英一数二/总分289/已过A区线
已经有8人回复
-
281求调剂（0805）
已经有21人回复
-
0817 化学工程 299分求调剂 有科研经历 有二区文章
已经有20人回复
-
279分求调剂 一志愿211
已经有6人回复
-
085600材料与化工 求调剂
已经有17人回复
-
能源材料化学课题组招收硕士研究生8-10名
已经有13人回复
-
317求调剂
已经有6人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 纤维素酶用什么缓冲液溶解啊？
已经有10人回复
- 关于酶用量的计算
已经有6人回复
- 联系导师的疑惑--联系过两个导师，但都很模糊啊？如何是好。。。
已经有4人回复
- 求助：PCR扩增片段测序结果引物中间多出150bp的片段
已经有5人回复
- 求助 高通量测序
已经有3人回复
- PCR产物经酶切电泳后所得的基因型与测序结果不一致，是何原因？该如何处理？
已经有10人回复
- 重组质粒双酶切问题
已经有5人回复
- pcr产物测序和克隆之后重组质粒测序结果一样吗？
已经有12人回复
- BL21(DE3)表达脂肪酶重组质粒，将菌体颜色偏白是是怎么回事
已经有17人回复
- 求助：关于重组质粒目的条带丢失
已经有9人回复
- 请教重组质粒快检的具体方法以及原理。。。。
已经有15人回复
- 【求助/交流】试剂盒提取重组质粒的A260/A280=2.08,求帮忙分析一下
已经有4人回复
- 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～
已经有16人回复
- 【求助/交流】重组质粒PCR的taq酶选择！
已经有11人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
坐标上海，诚征女友，非常 着急，私信必回
+1/463
-
祈福2026国基面上项目
+5/185
-
广东工业大学-木质纤维素高值化利用团队招博士研究生
+1/99
-
南京医科大学生殖医学与子代健康国重实验室-董飞宏课题组-学术硕士招生
+1/95
-
华南理工-广中医联合招收生物医学与材料交叉学科博士生
+1/85
-
光学工程学硕调剂信息
+2/44
-
华南师范大学（211）博士招生- 电子、自动化、机械、生物学、物理相关专业
+2/34
-
丽水学院 材料与能源工程学院 陈江飞老师课题组硕士招生----材料与化工专业
+1/17
-
211/双一流---石河子大学---有机化学方向招调剂生
+1/8
-
【博士招生】天津理工大学国家杰青王铁课题组招收2026年博士研究生
+1/8
-
【博士招生】武汉科技大学招收材料、化工、环境、冶金类2026年“申请-考核”制博士生
+1/7
-
香港大学David Srolovitz教授课题组招聘「香江学者」博士后
+1/6
-
【武汉高校】【新能源材料与器件课题组】 招收优秀硕士调剂生！！！
+5/5
-
中国科学院过程工程研究所助理研究员（正式职工）和博士后招聘启事
+1/4
-
中科院上海微系统所材料生长理论与仿真课题组-博士后招聘（材料计算与AI4S）
+1/4
-
武汉纺织大学杰青团队招研究生（材料，化学，高分子，化工）
+1/4
-
易度层流质量流量控制器在气液两相循环流动实验气体定量注液中的应用与优势
+1/3
-
海外博士招聘
+1/3
-
中国科学院地球化学研究所招科研助理
+1/1
-
北京高校副校长团队招收机械类，环境类学硕和专硕
+1/1
3楼2012-04-10 08:55:36
2楼2012-04-10 08:43:23
4楼2012-04-10 08:57:18
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
龙开聪: 金币+7, 谢谢，这两天做实验去了，都没空登陆论坛，建议不错，受益不浅 2012-04-12 17:03:32
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
龙开聪: 金币+7, 谢谢，这两天做实验去了，都没空登陆论坛，建议不错，受益不浅 2012-04-12 17:03:32
|
看来LZ很纠结这个质粒浓度低，呵呵！ 1）从你表述的来看，片段是连上了pET32了，测序结果也是正确的，酶切条带的亮弱直接与你提取的质粒浓度有关系，好像与酶切体系没多大关系。 2）试验中我也感觉pET系列载体copy数确实不太高，好像是中等拷贝吧，只好加大提取质粒的菌量了，从而提高质粒的浓度。 3）另外你用的BL21(DE3)是表达蛋白的宿主菌，如果你换用克隆表达宿主菌XL-1 blue或DH5a来提取质粒也许量就会多一些了。 祝实验顺利！ [ Last edited by srlee on 2012-4-11 at 12:49 ] |
5楼2012-04-10 22:17:34
