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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低
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龙开聪

金虫 (小有名气)

[交流] 十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低

我使用的载体是Pet-32a（+），宿主菌是BL21(DE3)，连接上目的基因后，提取重组质粒进行双酶切，30微升体系，酶切能看到两个条带，但目的基因被切下的条带很淡很淡，送出去测序，结果正确，但发送的报告反复说我质粒浓度很低，我进行表达后，确实表达量很不理想，用改目的基因连接到pcDNA3.1(+)上后，转化JM109，重新提取质粒，酶切使用了30微升体系，只看到载体的条带，使用了60微升体系后，目的基因的条带任然非常淡，近乎看不见，送重组菌出去测序，正反两个方向测序，却只有正一个方向有结果，表明我目的基因是连接上去了，但另一个方向测序却无结果，报告说质粒浓度太低，目的基因片段1100，测序公司为北京诺赛。求高手指点迷津，为何我质粒浓度这么低，导致酶切看不见双条带，原核表达量极低？
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1楼 2012-04-10 08:20:47
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★
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lz诱导表达的条件可以考虑修改一下~

葡萄糖是不是会一直pet系列载体的表达呢？
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2楼2012-04-10 08:43:23
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龙开聪

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-10 08:43:23:
lz诱导表达的条件可以考虑修改一下~

葡萄糖是不是会一直pet系列载体的表达呢？

我用50ml诱导表达 没有目的条带，没办法，加到500ML才看到目的条带，体积太大，我不好优化，关键我觉得可能是我质粒浓度低，所以表达量极低，不知如何解决啊
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3楼2012-04-10 08:55:36
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龙开聪

金虫 (小有名气)
我想在LB平板上加葡萄糖试试，但不知道LB平板是不是只加葡萄糖，那加不加氨苄呢，还是一起加？
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4楼2012-04-10 08:57:18
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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龙开聪: 金币+7, 谢谢，这两天做实验去了，都没空登陆论坛，建议不错，受益不浅 2012-04-12 17:03:32
看来LZ很纠结这个质粒浓度低，呵呵！
1）从你表述的来看，片段是连上了pET32了，测序结果也是正确的，酶切条带的亮弱直接与你提取的质粒浓度有关系，好像与酶切体系没多大关系。
2）试验中我也感觉pET系列载体copy数确实不太高，好像是中等拷贝吧，只好加大提取质粒的菌量了，从而提高质粒的浓度。
3）另外你用的BL21(DE3)是表达蛋白的宿主菌，如果你换用克隆表达宿主菌XL-1 blue或DH5a来提取质粒也许量就会多一些了。
祝实验顺利！

[ Last edited by srlee on 2012-4-11 at 12:49 ]
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5楼2012-04-10 22:17:34
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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龙开聪: 金币+3, 我表达用的是BL21，但表达量不高 2012-04-12 17:06:27
pET系列载体没有使用DH5a进行表达的吧，缺乏T7 RNA聚合酶。
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6楼2012-04-11 09:39:39
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zx6291

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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龙开聪: 金币+3, 表达的时候我诱导了，终浓度为1mM,但表达量低，我用了500mL电泳才可见目的条带，所以不好优化条件 2012-04-12 17:08:41
用IPTG诱导表达一下吧，在OD600在 0.6-0.8时候加入.
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7楼2012-04-11 11:02:21
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wanglei512

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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龙开聪: 金币+7, 嗯，我去试试，但我真核表达载体转化到JM109克隆菌，酶切条带还是不清晰 2012-04-12 17:05:21
引用回帖:
5楼: Originally posted by srlee at 2012-04-10 22:17:34:
看来LZ很纠结这个质粒浓度低，呵呵！
1）从你表述的来看，片段是连上了pET32了，测序结果也是正确的，酶切条带的亮弱直接与你提取的质粒浓度有关系，好像与酶切体系没多大关系。
2）试验中我也感觉pET系列载体c ...

把质粒重新在DH5@中转化一下，提取质粒后酶切效果很好，我以前也遇到过，这样做了效果很好
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8楼2012-04-11 16:40:59
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qqwang8706

新虫 (初入文坛)
★
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楼主你再做个平板塞选吧~！还是氨苄平板 挑单个菌落再弄一下！
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9楼2012-04-11 20:34:40
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desheng101

木虫 (正式写手)
★
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看楼主哭的这么伤心，赶紧来大虾帮帮楼主吧，我是来打酱油的，楼主别建议
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龙开聪
10楼2012-04-11 21:29:05
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龙开聪

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by desheng101 at 2012-04-11 21:29:05:
看楼主哭的这么伤心，赶紧来大虾帮帮楼主吧，我是来打酱油的，楼主别建议

做实验真痛苦啊，真羡慕文科生
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11楼2012-04-12 17:10:19
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desheng101

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
11楼: Originally posted by 龙开聪 at 2012-04-12 17:10:19:
做实验真痛苦啊，真羡慕文科生

文科生写文章也头疼哦，嘿嘿，调整心态吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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12楼2012-04-12 17:58:06
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zx6291

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by zx6291 at 2012-04-11 11:02:21:
用IPTG诱导表达一下吧，在OD600在 0.6-0.8时候加入.

IPTG一般加入浓度为0-1mM,可以做个浓度梯度，我一般用0.2或0.5mM,感觉你加了1mMIPTG,浓度有点高了,IPTG多了反而会产生毒性,过尤不及啊
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13楼2012-04-12 18:33:45
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M110899

金虫 (正式写手)
★
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楼主你好，我现在也在做载体构建，我的目的片段是IL-10，连接的也是PET-32a，后面也打算转化BL21（DE3）。最近片段和载体连接后，酶切看不到目的片段，请问你遇到过这种情况吗？
下面这张图从左到右依次为：1kb的marker，重组质粒，单切，双切，DL-1000marker。marker都是宝生物的
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14楼2012-05-05 15:02:18
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永不放弃0206

银虫 (初入文坛)
★
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学习，最近也在做这个
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15楼2013-04-09 09:44:04
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mxp2009

新虫 (初入文坛)
★
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不知道你用的载体有多大？若是载体：目的片段超过10:1的话，30体系双酶切下来就看不见目的条带了。
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16楼2013-04-27 18:48:27
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残月如冰任方

新虫 (初入文坛)
★
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你好，你的问题应该解决了吧，原因找到了吗？我现在也遇到了相同的问题。我载体是PET28a与PGEX4T-2，片段大小是600与1040，质粒条带还行，但酶切就切不开，送去测序说浓度太低。怎么回事呀？
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17楼2014-02-28 17:59:17
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