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sumoeric

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒出现问题

在构建一个质粒,已经将3个片段连接在了一体,并已经与T载体连接在了一起,经过验证是没问题的。现在准备将该目的片段从T载体上面酶切下来与pKC1139连接在一起。目的片段是5.5KB。已经做了两周了,每一次长出来的连质粒都没有,DH5α感受态没有什么问题,已经验证过了,转化的手法也应该没什么问题。

有没有可能是一直都连接不上呢??还有想求教下,DH5α能容纳的最大质粒是多少?
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你做过菌液鉴定没有,大小在8-9kb吗?
2楼2011-11-24 00:14:44
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sumoeric

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 保护你的大树 at 2011-11-24 00:14:44:
你做过菌液鉴定没有,大小在8-9kb吗?

您说的是之前的连接在T载体上的质粒吗?
我已经做过鉴定了大小没问题基本就在8kb多一点,而且酶切和PCR的验证也都是正确的。
3楼2011-11-24 08:17:18
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

酶切下了的片段回收浓度太低了   而且片段这么长  不好连
hold住
4楼2011-11-24 09:26:26
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by sumoeric at 2011-11-24 08:17:18:
您说的是之前的连接在T载体上的质粒吗?
我已经做过鉴定了大小没问题基本就在8kb多一点,而且酶切和PCR的验证也都是正确的。

你可以采用不同的质粒载体比例试试,长度应该还是可以的,我们实验室有人做过这样的长度也是可以的。
5楼2011-11-24 10:39:59
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sumoeric

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zc10052157 at 2011-11-24 09:26:26:
酶切下了的片段回收浓度太低了   而且片段这么长  不好连

浓度经过浓缩保证了较高的浓度,可是居然每一次都连接不上而且自连都没有
6楼2011-11-24 10:41:03
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潇洒姐

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以的话,换两种酶切试试
7楼2011-11-28 14:36:20
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0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖

楼主,你这个测序看看吧!
每天坚持多一点,以后困难少一点!
8楼2011-11-28 16:49:35
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syn1985

木虫 (正式写手)

楼主 你这个问题解决了吗?是啥原因啊?
9楼2012-04-27 19:37:16
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sumoeric

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by syn1985 at 2012-04-27 19:37:16:
楼主 你这个问题解决了吗?是啥原因啊?

解决倒是解决了  但是还是找不出原因来

把质粒送到北京的一个朋友那一次就做出来了。。。
10楼2012-05-24 17:39:08
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