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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组质粒出现问题
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sumoeric

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒出现问题

在构建一个质粒，已经将3个片段连接在了一体，并已经与T载体连接在了一起，经过验证是没问题的。现在准备将该目的片段从T载体上面酶切下来与pKC1139连接在一起。目的片段是5.5KB。已经做了两周了，每一次长出来的连质粒都没有，DH5α感受态没有什么问题，已经验证过了，转化的手法也应该没什么问题。

有没有可能是一直都连接不上呢？？还有想求教下，DH5α能容纳的最大质粒是多少？
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1楼 2011-11-23 17:00:32
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你做过菌液鉴定没有，大小在8-9kb吗？
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2楼2011-11-24 00:14:44
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sumoeric

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 保护你的大树 at 2011-11-24 00:14:44:
你做过菌液鉴定没有，大小在8-9kb吗？

您说的是之前的连接在T载体上的质粒吗？
我已经做过鉴定了大小没问题基本就在8kb多一点，而且酶切和PCR的验证也都是正确的。
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3楼2011-11-24 08:17:18
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

酶切下了的片段回收浓度太低了   而且片段这么长  不好连
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hold住
4楼2011-11-24 09:26:26
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by sumoeric at 2011-11-24 08:17:18:
您说的是之前的连接在T载体上的质粒吗？
我已经做过鉴定了大小没问题基本就在8kb多一点，而且酶切和PCR的验证也都是正确的。

你可以采用不同的质粒载体比例试试，长度应该还是可以的，我们实验室有人做过这样的长度也是可以的。
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5楼2011-11-24 10:39:59
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sumoeric

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zc10052157 at 2011-11-24 09:26:26:
酶切下了的片段回收浓度太低了   而且片段这么长  不好连

浓度经过浓缩保证了较高的浓度，可是居然每一次都连接不上而且自连都没有
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6楼2011-11-24 10:41:03
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潇洒姐

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以的话，换两种酶切试试
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7楼2011-11-28 14:36:20
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0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖

楼主，你这个测序看看吧！
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每天坚持多一点，以后困难少一点！
8楼2011-11-28 16:49:35
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syn1985

木虫 (正式写手)
楼主 你这个问题解决了吗？是啥原因啊？
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9楼2012-04-27 19:37:16
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sumoeric

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by syn1985 at 2012-04-27 19:37:16:
楼主 你这个问题解决了吗？是啥原因啊？

解决倒是解决了  但是还是找不出原因来

把质粒送到北京的一个朋友那一次就做出来了。。。
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10楼2012-05-24 17:39:08
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