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yanjun3830木虫 (正式写手)
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[求助]
请教一下构建、表达方面的问题
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| 为什么我构建的菌种只表达标签GST而不表达目的蛋白，想请教一下高手出现这种情况的原因会是什么呢？会不会是没连上，但是酶切鉴定还是好的啊！望这方面的高手给予指教，谢谢！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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dhd997(金币+5, EPI+1): 很专业了 2011-07-12 19:30:20
yanjun3830(金币+10): 谢谢，很不错的解答！ 2011-07-13 08:58:43
dhd997(金币+5, EPI+1): 很专业了 2011-07-12 19:30:20
yanjun3830(金币+10): 谢谢，很不错的解答！ 2011-07-13 08:58:43
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1、你是否确定你构建的载体是完全正确地，只靠酶切验证时不够的，做PCR验证，再测序。 2、你连接上的这个基因片段用表达载体上的启动子可以启动表达吗？如果不可以，要克隆出这个基因自身的启动子，构建到表达载体上。 3、有些蛋白的表达可能需要很多因素，例如是否要加诱导剂、是否要低温表达等。 由于我只是以前看同学做过蛋白表达，这些原因也是同学碰到过的，所以只能给你提供这些建议了，仅供参考。 |
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yanjun38302楼2011-07-12 12:44:53
【答案】应助回帖
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-12 19:30:49
yanjun3830(金币+5): 谢谢！ 2011-07-13 09:00:56
dhd997(金币+3): good 2011-07-12 19:30:49
yanjun3830(金币+5): 谢谢！ 2011-07-13 09:00:56
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1.宿主菌合适吗？会不会，把你的外源基因表达产物降解，或者有抑制其表达的因素。 2。考虑下目的基因的表达量，检测方法的准确及精确性。 |
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3楼2011-07-12 12:57:47
yanjun3830
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4楼2011-07-13 08:56:40
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5楼2011-07-13 09:01:46
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【答案】应助回帖
yanjun3830(金币+15): 谢谢回帖！ 2011-07-14 09:14:04
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我不知道你说的半分子、全分子是什么意思。貌似是说现在构建的载体插入的基因片段比以前的大，对吧？不知道你插入的是多大的基因片段呢？ 在这个全分子的基因扩增时有没有用高保真酶呢？因为大片段的基因在克隆时很容易发生突变，如果运气不好的话，突变在关键位点上，这个基因就不表达了呀。 |
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6楼2011-07-13 09:33:11
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7楼2011-07-14 09:13:39
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西瓜(金币+5, EPI+1): 一起奖励！ 2011-07-14 10:47:35
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500bp挺小的，不用高保真酶也可以。 我们构建重组质粒，连接上之后，做完PCR和酶切验证都要送去进行DNA测序的。所有的序列没有问题，才会进行后续的蛋白表达工作。 构建重组质粒有时候很简单，有时候又很麻烦，完全看你要表达的基因和用的载体。有时候基因还要克隆出自身的启动子和终止子，还有核糖体结合位点。 最好是问问懂的师兄师姐，以免浪费时间，走弯路。 |
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8楼2011-07-14 09:26:00
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西瓜(金币+5): 鼓励新虫交流 2011-07-14 17:08:25
西瓜(金币+5): 鼓励新虫交流 2011-07-14 17:08:25
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1.不知道你具体是做原核表达还是做真核表达，选用那种质粒。就我目前做过的表达，有的质粒是整合到宿主基因组中表达的，有的是在细胞质中独立表达的。不管是哪一种，就您目前遇到的问题，可能是转化筛选阶段出现问题。 2.从质粒构建到表达这个过程中，我每次都是挑取阳性克隆做菌落PCR，然后把符合预期的测序，对照读码框是否无误，最后才进行表达。 3.菌落PCR：如果你连入的片段和两个酶切位点之间的片段大小差异很大，那么你可以选择载体两端引物来鉴定；如果片段差异不大，那么要做载体两端引物和目的片段上游和下游引物同时鉴定，当然也可以用载体的上游引物和目的片段的下游或者目的片段的上游和载体的下游引物来鉴定。 希望这点经验能对您有所帮助。 |
9楼2011-07-14 16:31:22
10楼2011-07-14 21:17:37
