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yanjun3830木虫 (正式写手)
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[求助]
请教一下构建、表达方面的问题
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| 为什么我构建的菌种只表达标签GST而不表达目的蛋白，想请教一下高手出现这种情况的原因会是什么呢？会不会是没连上，但是酶切鉴定还是好的啊！望这方面的高手给予指教，谢谢！ |
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【答案】应助回帖
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西瓜(金币+5, EPI+1): 一起奖励！ 2011-07-14 10:47:35
西瓜(金币+5, EPI+1): 一起奖励！ 2011-07-14 10:47:35
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500bp挺小的，不用高保真酶也可以。 我们构建重组质粒，连接上之后，做完PCR和酶切验证都要送去进行DNA测序的。所有的序列没有问题，才会进行后续的蛋白表达工作。 构建重组质粒有时候很简单，有时候又很麻烦，完全看你要表达的基因和用的载体。有时候基因还要克隆出自身的启动子和终止子，还有核糖体结合位点。 最好是问问懂的师兄师姐，以免浪费时间，走弯路。 |
yanjun38308楼2011-07-14 09:26:00
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dhd997(金币+5, EPI+1): 很专业了 2011-07-12 19:30:20
yanjun3830(金币+10): 谢谢，很不错的解答！ 2011-07-13 08:58:43
dhd997(金币+5, EPI+1): 很专业了 2011-07-12 19:30:20
yanjun3830(金币+10): 谢谢，很不错的解答！ 2011-07-13 08:58:43
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1、你是否确定你构建的载体是完全正确地，只靠酶切验证时不够的，做PCR验证，再测序。 2、你连接上的这个基因片段用表达载体上的启动子可以启动表达吗？如果不可以，要克隆出这个基因自身的启动子，构建到表达载体上。 3、有些蛋白的表达可能需要很多因素，例如是否要加诱导剂、是否要低温表达等。 由于我只是以前看同学做过蛋白表达，这些原因也是同学碰到过的，所以只能给你提供这些建议了，仅供参考。 |
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2楼2011-07-12 12:44:53
【答案】应助回帖
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dhd997(金币+3): good 2011-07-12 19:30:49
yanjun3830(金币+5): 谢谢！ 2011-07-13 09:00:56
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yanjun3830(金币+5): 谢谢！ 2011-07-13 09:00:56
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1.宿主菌合适吗？会不会，把你的外源基因表达产物降解，或者有抑制其表达的因素。 2。考虑下目的基因的表达量，检测方法的准确及精确性。 |
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3楼2011-07-12 12:57:47
yanjun3830
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