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足下客

木虫 (正式写手)

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专业: 临床分子生物学检验

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 很专业了 2011-07-12 19:30:20
yanjun3830(金币+10): 谢谢，很不错的解答！ 2011-07-13 08:58:43

1、你是否确定你构建的载体是完全正确地，只靠酶切验证时不够的，做PCR验证，再测序。
2、你连接上的这个基因片段用表达载体上的启动子可以启动表达吗？如果不可以，要克隆出这个基因自身的启动子，构建到表达载体上。
3、有些蛋白的表达可能需要很多因素，例如是否要加诱导剂、是否要低温表达等。

由于我只是以前看同学做过蛋白表达，这些原因也是同学碰到过的，所以只能给你提供这些建议了，仅供参考。

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yanjun3830

2楼2011-07-12 12:44:53

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 一起奖励！ 2011-07-14 10:47:35

引用回帖:

Originally posted by yanjun3830 at 2011-07-14 09:13:39:
全分子包含N-端和C-端两个半分子，共有500个bp，我是学化学的，进实验室后都是跟别人学着做这些东东，貌似基因扩增时用的酶是新买的，是TaKaRa的，好像不是高保真的！

500bp挺小的，不用高保真酶也可以。
我们构建重组质粒，连接上之后，做完PCR和酶切验证都要送去进行DNA测序的。所有的序列没有问题，才会进行后续的蛋白表达工作。
构建重组质粒有时候很简单，有时候又很麻烦，完全看你要表达的基因和用的载体。有时候基因还要克隆出自身的启动子和终止子，还有核糖体结合位点。
最好是问问懂的师兄师姐，以免浪费时间，走弯路。