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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 很专业了 2011-07-12 19:30:20
yanjun3830(金币+10): 谢谢,很不错的解答! 2011-07-13 08:58:43
1、你是否确定你构建的载体是完全正确地,只靠酶切验证时不够的,做PCR验证,再测序。
2、你连接上的这个基因片段用表达载体上的启动子可以启动表达吗?如果不可以,要克隆出这个基因自身的启动子,构建到表达载体上。
3、有些蛋白的表达可能需要很多因素,例如是否要加诱导剂、是否要低温表达等。

由于我只是以前看同学做过蛋白表达,这些原因也是同学碰到过的,所以只能给你提供这些建议了,仅供参考。

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2楼2011-07-12 12:44:53
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智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 一起奖励! 2011-07-14 10:47:35
引用回帖:
Originally posted by yanjun3830 at 2011-07-14 09:13:39:
全分子包含N-端和C-端两个半分子,共有500个bp,我是学化学的,进实验室后都是跟别人学着做这些东东,貌似基因扩增时用的酶是新买的,是TaKaRa的,好像不是高保真的!

500bp挺小的,不用高保真酶也可以。
我们构建重组质粒,连接上之后,做完PCR和酶切验证都要送去进行DNA测序的。所有的序列没有问题,才会进行后续的蛋白表达工作。
构建重组质粒有时候很简单,有时候又很麻烦,完全看你要表达的基因和用的载体。有时候基因还要克隆出自身的启动子和终止子,还有核糖体结合位点。
最好是问问懂的师兄师姐,以免浪费时间,走弯路。

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8楼2011-07-14 09:26:00
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