| 查看: 3943 | 回复: 13 | |||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
yanjun3830木虫 (正式写手)
|
[求助]
请教一下构建、表达方面的问题
|
||
| 为什么我构建的菌种只表达标签GST而不表达目的蛋白，想请教一下高手出现这种情况的原因会是什么呢？会不会是没连上，但是酶切鉴定还是好的啊！望这方面的高手给予指教，谢谢！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有110人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于农杆菌单菌株/双质粒表达载体的构建问题
已经有14人回复
- 有关蛋白表达的问题
已经有25人回复
- 关于SiRNA表达载体构建的问题
已经有9人回复
- 表达载体构建的相关问题
已经有15人回复
- 请教个毕赤酵母表达的问题
已经有5人回复
- 小虫请教 差异基因表达 方面的问题
已经有9人回复
- 请教关于diamond的一些问题，此外请教如何描述一个配合物晶体呢（超分子方面）？
已经有9人回复
- 【求助/交流】pYES2 载体构建表达方向的问题
已经有8人回复
- 【求助/交流】关于绿色荧光蛋白表达问题
已经有10人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母表达载体的构建问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】构建的工程菌表达蛋白问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】关于质粒构建与表达的问题
已经有14人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母真核表达载体构建和连接的问题
已经有6人回复
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): 鼓励新虫交流 2011-07-14 17:08:25
西瓜(金币+5): 鼓励新虫交流 2011-07-14 17:08:25
|
1.不知道你具体是做原核表达还是做真核表达，选用那种质粒。就我目前做过的表达，有的质粒是整合到宿主基因组中表达的，有的是在细胞质中独立表达的。不管是哪一种，就您目前遇到的问题，可能是转化筛选阶段出现问题。 2.从质粒构建到表达这个过程中，我每次都是挑取阳性克隆做菌落PCR，然后把符合预期的测序，对照读码框是否无误，最后才进行表达。 3.菌落PCR：如果你连入的片段和两个酶切位点之间的片段大小差异很大，那么你可以选择载体两端引物来鉴定；如果片段差异不大，那么要做载体两端引物和目的片段上游和下游引物同时鉴定，当然也可以用载体的上游引物和目的片段的下游或者目的片段的上游和载体的下游引物来鉴定。 希望这点经验能对您有所帮助。 |
9楼2011-07-14 16:31:22
足下客
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 10
- 应助: 39 (小学生)
- 金币: 1858.8
- 散金: 211
- 红花: 12
- 帖子: 888
- 在线: 110.4小时
- 虫号: 426612
- 注册: 2007-07-28
- 性别: MM
- 专业: 临床分子生物学检验
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 很专业了 2011-07-12 19:30:20
yanjun3830(金币+10): 谢谢，很不错的解答！ 2011-07-13 08:58:43
dhd997(金币+5, EPI+1): 很专业了 2011-07-12 19:30:20
yanjun3830(金币+10): 谢谢，很不错的解答！ 2011-07-13 08:58:43
|
1、你是否确定你构建的载体是完全正确地，只靠酶切验证时不够的，做PCR验证，再测序。 2、你连接上的这个基因片段用表达载体上的启动子可以启动表达吗？如果不可以，要克隆出这个基因自身的启动子，构建到表达载体上。 3、有些蛋白的表达可能需要很多因素，例如是否要加诱导剂、是否要低温表达等。 由于我只是以前看同学做过蛋白表达，这些原因也是同学碰到过的，所以只能给你提供这些建议了，仅供参考。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
yanjun38302楼2011-07-12 12:44:53
【答案】应助回帖
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-12 19:30:49
yanjun3830(金币+5): 谢谢！ 2011-07-13 09:00:56
dhd997(金币+3): good 2011-07-12 19:30:49
yanjun3830(金币+5): 谢谢！ 2011-07-13 09:00:56
|
1.宿主菌合适吗？会不会，把你的外源基因表达产物降解，或者有抑制其表达的因素。 2。考虑下目的基因的表达量，检测方法的准确及精确性。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
3楼2011-07-12 12:57:47
yanjun3830
木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2208.6
- 散金: 78
- 红花: 2
- 帖子: 306
- 在线: 91.2小时
- 虫号: 1051135
- 注册: 2010-07-02
- 性别: GG
- 专业: 生物无机化学
4楼2011-07-13 08:56:40