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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教一下构建、表达方面的问题
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yanjun3830

木虫 (正式写手)

[求助] 请教一下构建、表达方面的问题

为什么我构建的菌种只表达标签GST而不表达目的蛋白，想请教一下高手出现这种情况的原因会是什么呢？会不会是没连上，但是酶切鉴定还是好的啊！望这方面的高手给予指教，谢谢！
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生活有时很无奈！
1楼 2011-07-12 10:43:16
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yanjun3830

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by 足下客 at 2011-07-13 09:33:11:
我不知道你说的半分子、全分子是什么意思。貌似是说现在构建的载体插入的基因片段比以前的大，对吧？不知道你插入的是多大的基因片段呢？
在这个全分子的基因扩增时有没有用高保真酶呢？因为大片段的基因在克 ...

全分子包含N-端和C-端两个半分子，共有500个bp，我是学化学的，进实验室后都是跟别人学着做这些东东，貌似基因扩增时用的酶是新买的，是TaKaRa的，好像不是高保真的！
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生活有时很无奈！
7楼2011-07-14 09:13:39
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 很专业了 2011-07-12 19:30:20
yanjun3830(金币+10): 谢谢，很不错的解答！ 2011-07-13 08:58:43
1、你是否确定你构建的载体是完全正确地，只靠酶切验证时不够的，做PCR验证，再测序。
2、你连接上的这个基因片段用表达载体上的启动子可以启动表达吗？如果不可以，要克隆出这个基因自身的启动子，构建到表达载体上。
3、有些蛋白的表达可能需要很多因素，例如是否要加诱导剂、是否要低温表达等。

由于我只是以前看同学做过蛋白表达，这些原因也是同学碰到过的，所以只能给你提供这些建议了，仅供参考。
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yanjun3830
2楼2011-07-12 12:44:53
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-12 19:30:49
yanjun3830(金币+5): 谢谢！ 2011-07-13 09:00:56
1.宿主菌合适吗？会不会，把你的外源基因表达产物降解，或者有抑制其表达的因素。
2。考虑下目的基因的表达量，检测方法的准确及精确性。
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yanjun3830
坚持，一秒钟，就离，成功，近一步！
3楼2011-07-12 12:57:47
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yanjun3830

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by 足下客 at 2011-07-12 12:44:53:
1、你是否确定你构建的载体是完全正确地，只靠酶切验证时不够的，做PCR验证，再测序。
2、你连接上的这个基因片段用表达载体上的启动子可以启动表达吗？如果不可以，要克隆出这个基因自身的启动子，构建到表达载 ...

上游引物是当初构建此蛋白的半分子的引物，半分子构建成功后表达量还是很不错的，现在只是把下游引物换成了全分子的引物，其他的都没变，可是构建了好几次都不表达目的蛋白，光表达GST。差不多花费了两个月了，烦人的很，学化学的人做生物真是伤不起啊！
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生活有时很无奈！
4楼2011-07-13 08:56:40
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