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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组质粒出现问题
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sumoeric

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒出现问题

在构建一个质粒，已经将3个片段连接在了一体，并已经与T载体连接在了一起，经过验证是没问题的。现在准备将该目的片段从T载体上面酶切下来与pKC1139连接在一起。目的片段是5.5KB。已经做了两周了，每一次长出来的连质粒都没有，DH5α感受态没有什么问题，已经验证过了，转化的手法也应该没什么问题。

有没有可能是一直都连接不上呢？？还有想求教下，DH5α能容纳的最大质粒是多少？
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1楼 2011-11-23 17:00:32
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sumoeric

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zc10052157 at 2011-11-24 09:26:26:
酶切下了的片段回收浓度太低了   而且片段这么长  不好连

浓度经过浓缩保证了较高的浓度，可是居然每一次都连接不上而且自连都没有
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6楼2011-11-24 10:41:03
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你做过菌液鉴定没有，大小在8-9kb吗？
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2楼2011-11-24 00:14:44
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sumoeric

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 保护你的大树 at 2011-11-24 00:14:44:
你做过菌液鉴定没有，大小在8-9kb吗？

您说的是之前的连接在T载体上的质粒吗？
我已经做过鉴定了大小没问题基本就在8kb多一点，而且酶切和PCR的验证也都是正确的。
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3楼2011-11-24 08:17:18
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

酶切下了的片段回收浓度太低了   而且片段这么长  不好连
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hold住
4楼2011-11-24 09:26:26
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