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happywyh

铁虫 (小有名气)

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[交流] 酶切验证条带不对

PCR产物和表达载体直接连，挑取转化子进行酶切验证，发现条带完全错误，一般有哪些原因导致这样的结果

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1楼 2012-06-18 22:12:01

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ilxly

木虫 (小有名气)

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★
happywyh(金币+1): 谢谢参与

怎么个错误法空载体还是切下来的大小不对?
yuany

2楼2012-06-19 09:27:42

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wangfei179

木虫 (小有名气)

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★
happywyh(金币+1): 谢谢参与

PCR产物建议先与T载体酶连转化，挑克隆子测序测验无误后再双酶切，与表达载体相连。否则引物非特异性很强的话，扩增的条带杂乱，酶切后当然条带不对。

3楼2012-06-19 14:14:46

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byqyli

铁杆木虫 (正式写手)

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★
happywyh(金币+1): 谢谢参与

可以对PCR产物回收后双酶切，再连接表达载体。

4楼2012-06-19 17:26:48

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happywyh

铁虫 (小有名气)

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引用回帖:

4楼: Originally posted by byqyli at 2012-06-19 17:26:48
可以对PCR产物回收后双酶切，再连接表达载体。

就是这样做的，但是酶切验证的时候发现条带大小不对，酶切位点也不对，压根就没对的地方，原因不明。

5楼2012-06-20 15:39:58

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byqyli

铁杆木虫 (正式写手)

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那么，你的PCR产物有没有测序看看？

6楼2012-06-21 08:49:44

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byqyli

铁杆木虫 (正式写手)

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引用回帖:

4楼: Originally posted by byqyli at 2012-06-19 17:26:48
可以对PCR产物回收后双酶切，再连接表达载体。

你的PCR产物要测序看看，正确了再连接表达载体。如果本身就不正确，怎么着都不对

7楼2012-06-21 08:50:48

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windsor2011

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★
happywyh(金币+1): 谢谢参与

最好是将PCR产物先进行酶切，再与载体进行连接，然后进行转化得到的单克隆提质粒进行没切鉴定，测序！在实验中必须要注意你酶切的位点是否对，所用的酶是否正确？

8楼2012-06-21 09:23:09

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gaolandragon

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★
happywyh(金币+1): 谢谢参与

你拿转化涂板长的菌落直接做酶切？

9楼2012-06-21 17:36:06

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tianlt

新虫 (初入文坛)

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★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

不要急功近利，一步步来，如果测序都没测，你确定没有在PCR时发生突变？你确定这就是你要的东东？本末倒置嘛

10楼2012-06-27 15:43:18

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