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静海

新虫 (小有名气)

[求助] 做限制性酶切，请帮忙分析下

第一次做限制性酶切，请大家帮忙分析下(*^__^*) 嘻嘻……
marker是5000。载体是3号是我的条带。我想教一下，
1.我的有4条带，从离加样孔最近的是不是依次为：载体、空载体、目的基因、杂质？
2.理想的情况是3条带么？跑的最慢的那条是未切的载体，亮度较小。其次是空载体和目的基因条带，亮度较大且二者相近。
3.从亮度来看，1、3条带和2、4、5有较大区别，是因为？
4.怎么改进呢？最大的问题是？
O(∩_∩)O谢谢~~~

限制酶切电泳图

[ Last edited by 1949stone on 2011-10-31 at 21:51 ]
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1楼 2011-10-31 18:46:13
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)
我觉得你应该把每个泳道对应点的样品是什么，要说清楚。
不然不好分析。
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2楼2011-11-01 12:59:08
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分子生物化学

金虫 (小有名气)

实验菜鸟

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-11-01 17:56:40
限制性内切酶在最佳环境在可以只切单一酶切位点，但是如果环境不适宜，它也有可能去切其他限制性内切酶的酶切位点，我估计你酶切条件不对，请参照酶的说明书改一下酶切条件。
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做实验有失败才能学到东西
3楼2011-11-01 15:58:05
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静海

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jingdejun at 2011-11-01 12:59:08:
我觉得你应该把每个泳道对应点的样品是什么，要说清楚。
不然不好分析。

做的是公共实验，只有3号的加样孔是我的样。质粒是pMD19-T。用的两种限制性酶：HindIII、EcoRI.
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4楼2011-11-02 19:55:58
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静海

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 分子生物化学 at 2011-11-01 15:58:05:
限制性内切酶在最佳环境在可以只切单一酶切位点，但是如果环境不适宜，它也有可能去切其他限制性内切酶的酶切位点，我估计你酶切条件不对，请参照酶的说明书改一下酶切条件。

你指的是酶的星活性是么？如果出去这个原因，还有可能是别的不？
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5楼2011-11-02 21:12:41
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静海

新虫 (小有名气)
★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流！ 2011-11-02 21:24:00
引用回帖:
3楼: Originally posted by 分子生物化学 at 2011-11-01 15:58:05:
限制性内切酶在最佳环境在可以只切单一酶切位点，但是如果环境不适宜，它也有可能去切其他限制性内切酶的酶切位点，我估计你酶切条件不对，请参照酶的说明书改一下酶切条件。

你指的是酶的星活性是么？如果除去这个原因，还有可能是别的不？
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6楼2011-11-02 21:13:24
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dream-fish

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

静海(金币+1): 2011-11-16 00:49:17
你做的是双酶切，那么我就理解为你是打算做了酶切之后连接到其他载体上面去。但是你的空载体是什么呢？如果也是pmd18-T那么，我认为你的酶切是完全失败的。T载体是不会切出三条带的。一般做双酶切，就是两条带。
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7楼2011-11-03 13:06:55
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静海

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by dream-fish at 2011-11-03 13:06:55:
你做的是双酶切，那么我就理解为你是打算做了酶切之后连接到其他载体上面去。但是你的空载体是什么呢？如果也是pmd18-T那么，我认为你的酶切是完全失败的。T载体是不会切出三条带的。一般做双酶切，就是两条带。

好受打击啊，做这个是想做个验证~~我现在刚开始接触，还是不太明白~~
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8楼2011-11-06 15:29:22
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dream-fish

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 静海 at 2011-11-06 15:29:22:
好受打击啊，做这个是想做个验证~~我现在刚开始接触，还是不太明白~~

这个可能是因为你基因内部有你用的酶的位点。用软件先认真分析下，或者把T载体送测序。
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9楼2011-11-16 14:40:41
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blastfeng

金虫 (正式写手)
★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流! 2011-11-17 00:09:38
既然是公共实验，要求不是很严格，不到你的酶切条件是什么，16摄氏度四小时还是过夜，主要在操作上，有时候很小的细节操作造成实验结果不同是很正常的，比如吹打次数上的不同
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生活就像PCR
10楼2011-11-16 17:37:36
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