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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒DNA可以不通过酶切直接跑电泳检测吗？
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wangy0908

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】质粒DNA可以不通过酶切直接跑电泳检测吗？

我最近做克隆，提取质粒DNA后，直接用以前扩增目的条带的引物来扩增质粒DNA，想看看是否是阳性的克隆，可是怎么也扩增不出来，所以第一个问题是请教各位：是否可以用这样的引物来扩增？我个人感觉理论上是可以的！
其次是，我的质粒DNA是不是有问题，也会导致这样的情况，那么就想请教质粒DNA是否不需要经过酶切而直接跑电泳检测呢？
以及如何来检测阳性克隆是做好的方法？谢谢大家

我筛选单菌落是用的IPTG和X-GOL，也就是挑选白色的单菌落后培养提取质粒DNA！
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1楼 2011-04-06 10:12:33
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-06 12:20:36:
用你的引物来鉴定是没有问题的，确实单酶切之后效果会好，但得保证你的酶切位点不在PCR引物中。

个人认为你提取的质粒跑电泳是没有意义的。因为蓝白斑筛选也会有假阳性产生，特别是用pMD-18T载体，比20T的效 ...

我没有进行酶切，就直接跑的PCR，怎么也扩增不出来。我用的是pGEM-T载体。
谢谢。还想问问，如果不酶切跑PCR，能跑出来的吗？因为如果能跑出来的话，我就觉得我的质粒DNA是肯定有问题了，就得重新再做链接以及转化这些的。
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9楼2011-04-07 07:18:00
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-04-06 10:43:17:
直接用是可以的，只要引物3‘和模板匹配较好就可以了，建议PCR时质粒模板先单酶切处理，这样PCR容易。质粒电泳如果看大小的话最好单酶切处理，不酶切的话电泳表现分子大小与实际大小有差别的。

谢谢。我跑的PCR的时候没有进行单酶切。如果不进行单酶切，能跑出来吗？
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10楼2011-04-07 07:23:20
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wangy0908

金虫 (正式写手)
希望能好运的啊，快做出来的，都做了很久了！
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13楼2011-04-07 10:41:20
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wangy0908

金虫 (正式写手)
今天我重新做了一次PCR，以前次PCR产物胶回收后作为模板，两次PCR的引物是一样的，但是今天得到的条带的大小明显比以前小了1kb左右，很是费解！这是什么原因造成的啊？因为我打算重新做链接和转化，所以就索性想这样来检查一下DNA，以找到什么地方有问题的！结果却出现了这样的现象！
为什么会出现这样的情况呢？
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15楼2011-04-08 05:08:35
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wangy0908

金虫 (正式写手)
还有其他正解没有？谢谢大家
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20楼2011-04-10 22:28:18
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-11 12:25:04:
菌液pcr跟质粒pcr基本一样，一般把一个菌落挑到400ml培养基里摇2h就可以拿来做pcr了，取2-3ul当模板就够了，PCR程序跟质粒pcr一样

PCR程序跟质粒pcr一样,could you please give a pcr protocol  for plasmid?

thanks very much
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23楼2011-04-11 20:43:03
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