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wangy0908

金虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】质粒DNA可以不通过酶切直接跑电泳检测吗?

我最近做克隆,提取质粒DNA后,直接用以前扩增目的条带的引物来扩增质粒DNA,想看看是否是阳性的克隆,可是怎么也扩增不出来,所以第一个问题是请教各位:是否可以用这样的引物来扩增?我个人感觉理论上是可以的!
其次是,我的质粒DNA是不是有问题,也会导致这样的情况,那么就想请教质粒DNA是否不需要经过酶切而直接跑电泳检测呢?
以及如何来检测阳性克隆是做好的方法?谢谢大家

我筛选单菌落是用的IPTG和X-GOL,也就是挑选白色的单菌落后培养提取质粒DNA!
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wangy0908

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-06 12:20:36:
用你的引物来鉴定是没有问题的,确实单酶切之后效果会好,但得保证你的酶切位点不在PCR引物中。

个人认为你提取的质粒跑电泳是没有意义的。因为蓝白斑筛选也会有假阳性产生,特别是用pMD-18T载体,比20T的效 ...

我没有进行酶切,就直接跑的PCR,怎么也扩增不出来。我用的是pGEM-T载体。
谢谢。还想问问,如果不酶切跑PCR,能跑出来的吗?因为如果能跑出来的话,我就觉得我的质粒DNA是肯定有问题了,就得重新再做链接以及转化这些的。
9楼2011-04-07 07:18:00
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whilecy

银虫 (初入文坛)


虽然不懂,但觉得你的研究很有前途,路过~
2楼2011-04-06 10:24:21
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★ ★ ★ ★
1949stone(金币+4): 鼓励 2011-04-06 14:06:25
wangy0908(金币+10): 2011-04-06 20:58:11
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-06 10:12:33:
我最近做克隆,提取质粒DNA后,直接用以前扩增目的条带的引物来扩增质粒DNA,想看看是否是阳性的克隆,可是怎么也扩增不出来,所以第一个问题是请教各位:是否可以用这样的引物来扩增?我个人感觉理论上是可以的! ...

直接用是可以的,只要引物3‘和模板匹配较好就可以了,建议PCR时质粒模板先单酶切处理,这样PCR容易。质粒电泳如果看大小的话最好单酶切处理,不酶切的话电泳表现分子大小与实际大小有差别的。
3楼2011-04-06 10:43:17
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1949stone(EPI+1): 学习下 2011-04-06 14:07:00
wangy0908(金币+20): 2011-04-06 20:59:17
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-06 10:12:33:
我最近做克隆,提取质粒DNA后,直接用以前扩增目的条带的引物来扩增质粒DNA,想看看是否是阳性的克隆,可是怎么也扩增不出来,所以第一个问题是请教各位:是否可以用这样的引物来扩增?我个人感觉理论上是可以的! ...

用你的引物来鉴定是没有问题的,确实单酶切之后效果会好,但得保证你的酶切位点不在PCR引物中。

个人认为你提取的质粒跑电泳是没有意义的。因为蓝白斑筛选也会有假阳性产生,特别是用pMD-18T载体,比20T的效果好差一些,当然价格上也便宜一些。lz的情况应该是假阳性克隆,最好不要单独根据颜色来筛选,可以采用菌落PCR先初步鉴定,然后摇菌提质粒,得到质粒后可以PCR,最好也单酶切后电泳来鉴定。不酶切直接跑电泳可能出现的情况比较复杂,不好判断。
4楼2011-04-06 12:20:36
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