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friya0910新虫 (正式写手)
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质粒是否需要酶切后再电泳？ 已有5人参与
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| 将连接有目的片段的质粒做双酶切，跑电泳的时候想加一个空质粒，那这个空质粒是不是应该先单酶切一下啊？不然跑出来的不是线性的话就和前面双酶切的就没有可比性了啊？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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2楼2011-07-04 21:32:53
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dhd997(金币+5, EPI+1): 辛苦，一并奖励了 2011-07-05 19:16:27
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我现在只是把目的片段连接到了pMD19-T载体上，还没做到双酶切重组质粒这一步，我现在就想把目的片段从pMD19-T载体上切下来，切完之后跑胶需不需要加一个空载体做对照啊？ 原来是TA克隆，目的是看有没有连接上外源片段。你没有必要双酶切那么费事的，单酶切就可以了。你这样做是需要加一个对照的，对照应该为空载体，选用的酶切位点最好是外源片段上没有的位点，同时在载体上只有一个位点，这样切出来无论是有没有带有外源片段，都是一条带，但是带有外源片段的质粒条带会大于不带外源片段的质粒。 如果是只在外源片段上有但是载体上没有的位点，那么如果酶失效了，或者其它原因导致酶切不成功，那么质粒就不被切开，判断起来就稍微麻烦了些。 还有一个问题是我才发现pMD19-T载体在TA克隆位点后居然有我的下游引物的酶切位点BamHI 这样会不会影响酶切啊？最后双酶切以后会是3条带吗？ 不一定是三条带，如果两个位点之间相隔很近，那么切出来的条带会很短，跑胶的时候会跑出去根本看不见，毕竟在多克隆位点处的酶切位点是很密集的。你选用的鉴别方法可以再仔细考虑一下，包括单酶切还是双酶切，选用什么酶。 |
9楼2011-07-05 18:48:56
liling77ll
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