24小时热门版块排行榜    

查看: 2400  |  回复: 5
本帖产生 1 个 MolEPI ,点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

goumiaoge

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒双酶切问题

各位大侠,客套话就不多说了,请包涵。我在做原核表达,重组质粒转化到BL21后,做菌液PCR无目的条带,提质粒后做质粒PCR有目的条带,但是双酶切却切不出条带来,何解?
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cyzhgt

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!确实如此,应该先转化到克隆菌株,验证质粒正确后再转化到表达菌株。 2011-08-01 16:58:03
1、每个酶都做一个单酶切,确定内切酶没有问题
2、BL21(DE3)是表达菌株,我觉得应该先把重组质粒转到克隆菌株如DH5a、Top10上,然后再提质粒再做双酶切,因为不同菌株的基因型不一样,对质粒的修饰可能也不一样,有一些酶对甲基化的位点是没有作用的。
暂时就想到这么多。。。
4楼2011-08-01 09:57:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答

futuregarden

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 欢迎新虫交流 2011-08-01 16:56:35
个人理解
1.用PCR引物测序看一下是否是目的基因。
若是,看酶切位点是否正确,
若有酶切位点,那就是酶切体系的原因了
2楼2011-07-31 10:39:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

goumiaoge

新虫 (初入文坛)

酶切体系的影响真会这么大吗?我更改过几次体系,都不行,会不会有其他什么原因。我是测序正确后才转化的。酶切位点没有问题。我如果继续切不出来的话,还能做后面的诱导表达吗?
3楼2011-08-01 09:40:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-08-01 16:58:35
1、你提取的质粒浓度怎么样??
2、你的双酶切体系是??酶是否失活
建议20微升的体系,质粒2-5微升,同时做单酶切和双酶切验证
5楼2011-08-01 09:57:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见(F口面上) +4 gdd2018 2026-08-28 5/250 2026-08-28 12:41 by Tide man
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +3 bud_bud 2026-08-27 6/300 2026-08-28 11:53 by bud_bud
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的? +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-28 11:48 by winsaint
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+5) +12 晴天加油 2026-08-26 13/650 2026-08-28 11:32 by skyjudy
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高,自己申请怎么就这么难 +10 Kittylucky 2026-08-27 11/550 2026-08-28 10:45 by Kittylucky
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 基金未中,这种答复是模板吗? +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜? 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 我不理解! +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国际合作可查了,中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 国合现在查不到了吗? +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 牛来!米来!面来! +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候,我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办? +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
信息提示
请填处理意见