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天使托

专家顾问 (职业作家)

[交流] 请教重组质粒快检的具体方法以及原理。。。。

昨日看见某帖子说关于验证重组载体，楼下有位朋友说用快检的方法可以迅速检测出来。。。

这是该朋友的回帖的原内容：
快检就是直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心，
取上清跑胶，对照上个空载体，就是没有连片段前的质粒（环合的哈），
或者和你载体差不多大小的质粒也可，一般连进去的重组质粒会跑得慢点，
凭这个就能鉴定哪些连进去了，然后再提质粒酶切就好了

因为我们实验室就是一般的PCR，酶切质粒来验证，快检没有做过，所以我想问问大家具体的方法是什么？原理又是怎样？谢谢了！
苯酚和氯仿的作用是什么呢？

谢谢了。。。。。
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1楼 2011-04-29 10:45:38
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
天使托(金币+3): 谢谢了。。。。很好很强大！ 2011-04-29 12:25:46
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-04-30 09:16:11
快检就是直接比较质粒大小
用酚氯仿破菌后，离心后DNA和RNA都在上层水相里，
跑胶一般情况下能看见五条带，最上面是大肠杆菌的总DNA，第二条就是你的超螺旋的质粒，下面三条小的就是RNA，连进去的重组质粒和你的空载体大小有差别，大的跑胶跑得慢，空载体跑得快，电泳一看就一目了然了
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7楼2011-04-29 11:53:18
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
天使托(金币+1): 原理是什么呢？ 2011-04-29 11:24:39
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-29 10:45:38:
昨日看见某帖子说关于验证重组载体，楼下有位朋友说用快检的方法可以迅速检测出来。。。

这是该朋友的回帖的原内容：
快检就是直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心，
取上清跑胶，对 ...

直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心

这一步就是粗提质粒吧，然后跑胶对比质粒大小？
我是这么理解的

不过我们实验室一般是要酶切验证的，这个对构建前后质粒差别较大的才有用
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3楼2011-04-29 11:08:43
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小小_木虫

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
以前听一个师兄好像说过快速提质粒的方法，和这个快检差不多，但是没有细问，期待大家的答案。
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4楼2011-04-29 11:09:35
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by xuguanghai at 2011-04-29 11:08:43:
直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心

这一步就是粗提质粒吧，然后跑胶对比质粒大小？
我是这么理解的

不过我们实验室一般是要酶切验证的，这个对构建前后质粒差别较大的才有用

这是一个不严谨的判断吧，就是比较质粒大小
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6楼2011-04-29 11:37:02
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