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nestzhao

木虫 (小有名气)

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虫号: 906981

[交流] 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～

一直在做质粒构建的工作，时间已经花了好几个月了，但是一直没有结果。各种反应条件，连接体系等都试过，都没什么用。我实在是找不出什么原因了？或者本来我这个载体的选择或者酶切位点的选择就不太对？希望高手能够指点一下！！多谢了！！

我这个质粒构建的相关信息如下：
载体：pET28b(+)
片段长度：1.6kb左右
酶切位点：Nco I CATGCCATGG （下划线为酶切位点，前面的为保护碱基）
CGGGATCC
连接用T4DNA连接酶连接
16度水浴过夜

尝试过多次，连接后大多数时间没有出现出现阳性转化子，偶尔有阳性转化子，但是是假阳性的。
同时构建的另一个基因已经构建好了，用的载体和感受态细胞都是一样，所以这两个应该没什么问题。

我实在找不出问题出在哪了，希望高手指点！！！

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1楼 2011-03-09 22:50:03

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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

★
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 12:12:45
lstt09nk(金币+1): 希望对楼主有所帮助 2011-03-10 13:07:20

引用回帖:

Originally posted by nestzhao at 2011-03-10 08:46:53:
培养基里面加葡萄糖？加在倒平板的固体培养基中？？还是所有的培养基都加？？

恩，在LB里面加。转化出来涂板用的培养基中加入1%葡萄糖。

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9楼2011-03-10 09:23:48

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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

★
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 08:47:10
lstt09nk(金币+1): 感谢交流 2011-03-10 13:05:19

引用回帖:

Originally posted by nestzhao at 2011-03-09 22:50:03:
一直在做质粒构建的工作，时间已经花了好几个月了，但是一直没有结果。各种反应条件，连接体系等都试过，都没什么用。我实在是找不出什么原因了？或者本来我这个载体的选择或者酶切位点的选择就不太对？希望高手能 ...

可能是微量的表达对宿主有影响。可以尝试用培养基里面加葡萄糖。

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2楼2011-03-09 23:31:56

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