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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～
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nestzhao

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～

一直在做质粒构建的工作，时间已经花了好几个月了，但是一直没有结果。各种反应条件，连接体系等都试过，都没什么用。我实在是找不出什么原因了？或者本来我这个载体的选择或者酶切位点的选择就不太对？希望高手能够指点一下！！多谢了！！

我这个质粒构建的相关信息如下：
载体：pET28b(+)
片段长度：1.6kb左右
酶切位点：Nco I  CATGCCATGG  （下划线为酶切位点，前面的为保护碱基）
                 CGGGATCC
连接用T4DNA连接酶连接
16度水浴过夜

尝试过多次，连接后大多数时间没有出现出现阳性转化子，偶尔有阳性转化子，但是是假阳性的。
同时构建的另一个基因已经构建好了，用的载体和感受态细胞都是一样，所以这两个应该没什么问题。

我实在找不出问题出在哪了，希望高手指点！！！
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1楼 2011-03-09 22:50:03
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zhengfan1109

银虫 (正式写手)
★
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 08:47:05
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流，欢迎常来 2011-03-10 13:05:49
排除感受态和载体问题，我想连接酶，试剂的问题也排除了。
考虑一种可能性：
不知道LZ知道你要连接的这段DNA的序列吗？
是否有可能序列中包含两个酶切位点的序列，考虑更改内切酶。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-03-10 01:13:50
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 08:47:10
lstt09nk(金币+1): 感谢交流 2011-03-10 13:05:19
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-09 22:50:03:
一直在做质粒构建的工作，时间已经花了好几个月了，但是一直没有结果。各种反应条件，连接体系等都试过，都没什么用。我实在是找不出什么原因了？或者本来我这个载体的选择或者酶切位点的选择就不太对？希望高手能 ...

可能是微量的表达对宿主有影响。可以尝试用培养基里面加葡萄糖。
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2楼2011-03-09 23:31:56
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magy2006

木虫 (著名写手)
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 08:49:04
片段长，难连接，正常现象，连接时间加长，使用好一些的感受态或许有好的结果……
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4楼2011-03-10 08:19:47
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-09 23:31:56:
可能是微量的表达对宿主有影响。可以尝试用培养基里面加葡萄糖。

培养基里面加葡萄糖？加在倒平板的固体培养基中？？还是所有的培养基都加？？
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5楼2011-03-10 08:46:53
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