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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么最近做连接转化总是失败
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nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)

[求助] 为什么最近做连接转化总是失败

本人最近用TaKaRa的pMD18-T Vector做连接转化，感受态用过自己做的和别人做的都不长菌落，也用过买的感受态，只长了不到10个菌落挑单克隆后做菌液PCR检测发现都是空载，请问是什么原因？请各位高手指教一下！！谢啦！（我的回收产物大小在600~700bp之间，回收产物4ul，载体1ul，SolutionI 5ul，16°C连接1h）
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1楼 2012-02-24 13:36:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zoeye

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3, MolEPI+1): 很有用哦 2012-02-27 10:50:18
1、可以先用感受态转质粒看看 检查下是不是感受态的问题
2、新倒一批板 排除板的问题
3、连接比例 如果我没记错的话 应该是
（载体用量 如：100ng）/载体碱基数：T载大小）/（片段用量/片段碱基数600bp)=1:3 这个公式算一下（应该是的 建议你查一下 我经常会把两个比例记反）
4、你应该是用Taq酶P的吧 不是的话记得要加A~~~
5、连接时间 我一般都是4°过夜的 如果楼主不急 就延长一下连接时间吧
6、多转一点吧 虽然我也是转的10微升 你就转20好了
TaKaRa的pMD18-T Vector我一直在用 觉得很好用 很好构的
建议楼主在连接的时候可以把载体片段的量多做几管 不同比例 然后分别转化 看看会不会好一点
希望对你有帮助
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12楼2012-02-26 01:05:39
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wuxmxjtu

禁虫 (初入文坛)
wanhscn(金币+2): 有道理！ 2012-02-25 15:53:05
西瓜: 回帖置顶 2012-02-25 19:20:18
本帖内容被屏蔽
4楼2012-02-24 20:22:24
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普通回帖

angie8610

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
会不会是氨苄过量了。。。。。。
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新手上路，多多关照！
2楼2012-02-24 14:58:03
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nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by angie8610 at 2012-02-24 14:58:03:
会不会是氨苄过量了。。。。。。

100ml的LB固体培养基我加了110ul的氨苄，不会太多吧
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3楼2012-02-24 18:53:13
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eagle00768

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用invitrogen 的pENTR载体试试，那个转化效率挺高的
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5楼2012-02-25 13:07:11
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lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
对的，同意三楼的，做个对照试验，我也有过这样的情况，可能是没有连接上
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6楼2012-02-25 13:55:47
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nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by wuxmxjtu at 2012-02-24 20:22:24:
建议转化的时候，做一个对照试验。用没有连接外来片段的质粒转化细菌作为对照，一对照就知道问题大概在哪儿了

做过对照实验，用以前提的质粒转过，是成功的，难道就是连接有问题吗？以前也是这样连接的几乎都成功啊
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7楼2012-02-25 16:17:32
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nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by eagle00768 at 2012-02-25 13:07:11:
用invitrogen 的pENTR载体试试，那个转化效率挺高的

TaKaRa的pMD18-T Vector转化效率应该也可以啊，以前一直用这个的，没有出现这种情况，是不是回收的片段有问题啊会影响连接？
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8楼2012-02-25 16:43:44
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eagle00768

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by nan_nan_2012 at 2012-02-25 16:43:44:
TaKaRa的pMD18-T Vector转化效率应该也可以啊，以前一直用这个的，没有出现这种情况，是不是回收的片段有问题啊会影响连接？

同意楼上几位所说的，转个空载体做个对照，同时转，看是不是真的连上了。如果没连上的话，建议换个载体吧。不过用pENTR的话正向引物前面要再加CACC，PCR产物是平末端的
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9楼2012-02-25 16:55:55
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eagle00768

木虫 (小有名气)
wanhscn(金币+5): 应助很踊跃，5金币奖励 2012-02-25 17:18:50
西瓜(金币+2): 鼓励热心应助 2012-02-25 19:22:50
引用回帖:
8楼: Originally posted by nan_nan_2012 at 2012-02-25 16:43:44:
TaKaRa的pMD18-T Vector转化效率应该也可以啊，以前一直用这个的，没有出现这种情况，是不是回收的片段有问题啊会影响连接？

回收的片段不大阿，应该不会有什么问题
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10楼2012-02-25 16:57:43
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