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【求助/交流】长片段的连接转化已有6人参与
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最近在做一个长片段的连接，载体4.5kb，片段7kb，做了好多次都没结果，转化大肠杆菌，化转电转都有尝试。 连接应该没有问题，能够连上，觉得主要原因在于转化，第一，感受态效率不高，第二，开环状态不容易进去， 请教长片段连接的注意事项，或是分享连接成功的经验，谢谢！ |
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空谷幽风
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scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-06-07 22:03:57
wwdxx2004(金币+2):谢谢 2010-06-08 20:05:34
wwdxx2004(金币+2): 2010-06-09 22:36:26
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-06-07 22:03:57
wwdxx2004(金币+2):谢谢 2010-06-08 20:05:34
wwdxx2004(金币+2): 2010-06-09 22:36:26
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1.你的片段序列是否正确，如果还不确定先连到PUC57里面去测个序，正确后再连接目标载体。 2.连接时片段和载体的比例控制在3:1到5:1之间，载体去磷酸化可提高阳性率。 3.如果怀疑感受态细胞的效价建议买商品化的感受态细胞，不算贵，一管大概10块钱左右吧。 4.适当延长连接时间，很多实验室连接过夜后再转化。 另外T4DNA连接酶是热敏感性很强的酶，如果温度超过25度酶活性会急剧降低。祝你成功 |
8楼2010-06-07 21:20:41
srlee
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1949stone(金币+2):学习交流 2010-06-06 23:30:50
wwdxx2004(金币+2):谢谢 2010-06-07 10:16:08
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1949stone(金币+2):学习交流 2010-06-06 23:30:50
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wwdxx2004(金币+2): 2010-06-09 22:36:13
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前一段时间也做了大片段连接，开始也总是没有转化子出现，电转化时还经常爆杯，后来用一个连接试剂盒终于做成功了。 我觉得连接注意的事项主要有：（1）首先载体去磷酸化，可以提高连接效率。（2）合适的载体DNA和插入DNA的浓度比也很重要。（3）载体和插入片段制备好后最好及时连接，以保证新鲜度。（4）连接完成后失活连接酶，可以提高转化效率。（5）制备较高效率的化感及电感受态细胞。（6）连接完成后添加合适的量至感受态细胞中，过量也会造成转化效率不高。（7）还有就是，涂板时用的平板最好是新鲜的，不要放置过久。不然平板容易干涂布时不易涂匀，并且抗性也会变得很差，影响阳性克隆出现。 以上仅供参考，实验做得多了也就有经验了，慢慢来，祝实验顺利！ [ Last edited by srlee on 2010-6-7 at 00:00 ] |
2楼2010-06-06 22:05:34
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