应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教一下连接与转化问题！
51/1返回列表
查看: 2747  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 请教一下连接与转化问题！

各位大侠你们好！我想请教一下一个问题，我现在做的是串联表达，我是先分别扩增两段长度一样的串联片段，并且串联片段的序列都是重复的，然后我在这两段串联片段设计一个相同的限制性内切酶，目的是通过这个酶把这两段串联的片段连接起来，这样的话，我串联的长度就延长了，我现在时扩增的两段片段也都扩出来了，两段片段的大小都是350bp左右，然后双酶切，第一段片段我用ECORI和Sal I双酶切，第二段我用Sal I和Xhol I双酶切，条带也都有，然后我把这两段双酶切回收的产物和PET-30a（+）载体双酶切【载体用ECORI，Xhol I双酶切回收】这三段我在一个体系里面连接，然后转化，但是最后我挑菌进行pcr鉴定扩出来的条带大小只有350bp多，按说连上应该是680bp多，双酶切鉴定也没有那条目的条带的条带，这样不是说我没连上吗，这样的话我应该怎样改进啊？请各位指导一下！谢谢！我以前做出来的一段串联片段也是按这种方法做的，测序也都正确！
回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

freedom

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-12-11 09:17:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-12-11 21:56:00
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2011-12-11 10:11:22:
如果你去测序，就会发现克隆到你的载体中的都是第一个片段（EcoRI+SalI)，原因很简单，salI和XhoI是同粘酶（酶切后产生的粘性末端一样）。改进方法很简单：将XhoI或者SalI合成其他合适的酶就行了

都忘了同粘酶的定义了，汗，赶紧搜了下：
同粘酶:
      识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端。

刚看了下，Sal I和Xho I的位点最外面的一个碱基是不一样的啊，这两个就不算同粘酶了吧？
Xho I     C|TCGAG
            GAGCT|C

Sal I     G|TCGAC
           CAGCT|G
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-12-11 18:14:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): Good！ 2011-12-11 17:55:31
XUMIN6891(金币+2): 2011-12-22 08:51:27
如果你去测序，就会发现克隆到你的载体中的都是第一个片段（EcoRI+SalI)，原因很简单，salI和XhoI是同粘酶（酶切后产生的粘性末端一样）。改进方法很简单：将XhoI或者SalI合成其他合适的酶就行了
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-12-11 10:11:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

将XhoI或者SalI换成其他合适的酶就行了
赞一下 回复此楼
3楼2011-12-11 10:12:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

j2

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2011-12-11 10:11:22:
如果你去测序，就会发现克隆到你的载体中的都是第一个片段（EcoRI+SalI)，原因很简单，salI和XhoI是同粘酶（酶切后产生的粘性末端一样）。改进方法很简单：将XhoI或者SalI合成其他合适的酶就行了

请教一下，末端一样就不可能出现第1,2连接后于载体连接的情况么？还是只是这种几率太低，基本做不出来
赞一下 回复此楼
修炼ｉｎｇ，当虫仙……
4楼2011-12-11 16:22:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +7 kulium 2026-08-21 8/400 2026-08-21 18:38 by 陈晨晨陈啊
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 人气不行了 +7 fansofjerry 2026-08-21 7/350 2026-08-21 14:13 by Vivilian
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +23 yaoyewhu2008 2026-08-20 25/1250 2026-08-21 12:19 by Poppy1104
[基金申请] 什么时候开奖？ +7 CrisMessi 2026-08-18 7/350 2026-08-21 12:15 by weiyin
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +15 archvillain 2026-08-15 27/1350 2026-08-21 11:32 by tim76
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 13/650 2026-08-21 08:30 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +4 archvillain 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:10 by gatelove
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭