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南海所老龚

新虫 (正式写手)

[求助] TA克隆遇到的问题

各位晚上好，最近做克隆，一直做不出来，很是郁闷。希望各位虫子能够解疑。问题如下：
我克隆程序是涂板、菌落PCR检测、扩大培养。以下图片是我PCR检测的结果，最亮的带为目的片段（带虽然不是很亮很纯），接着220rpm，37摄氏度扩大培养，两天后都没长起来，什么原因？（PS:扩大培养用培养液与平板成分除前者未加琼脂粉之外其余均一致)
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
1楼 2011-08-22 22:58:24
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wyzl2007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你这种情况从未遇到！！！单从图中看，你的PCR反应体系及程序是有问题的！！！
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2楼2011-08-23 08:58:17
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longage.gene

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
南海所老龚(金币+1): 因为PCR检测时，菌落已经比较大，放在4度冰箱，约2小时候扩大培养。 2011-08-23 14:30:02
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-08-23 19:13:13
1. 菌落pcr说明问题不严谨，只能作为没问题时的确认方法，
2. 你的primer在菌的基因中又没结合点，
3. 菌落pcr时，菌如何保存的？
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3楼2011-08-23 10:34:51
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wyzl2007 at 2011-08-23 08:58:17:
你这种情况从未遇到！！！单从图中看，你的PCR反应体系及程序是有问题的！！！

你好。PCR体系及程序问题出在哪里？这至多说明菌落不纯，导致结果出现多条带。
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
4楼2011-08-23 14:35:42
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-08-23 19:13:29
1.只是菌液PCR验证不一定完全可靠,没摇起来可能就是没连接成功，但一定确认抗性没有搞错或是抗生素没有出现问题。
2.设置个正对照，在同样条件下再做一次试试
3.确保你的PCR产物末端有加有A
4.胶图杂带太多了，提高退火温度试试。
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5楼2011-08-23 15:51:08
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tonghust

新虫 (初入文坛)
这就是我为什么一直不喜欢菌落直接挑克隆pcr。先挑克隆到EP管中摇，摇的时候做一个阴性对照，用100-200ul培养基摇1个小时以上，然后再做PCR，多好。。。
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6楼2011-08-23 20:10:29
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
扩大培养多大体积？
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
7楼2011-08-23 21:16:46
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by tonghust at 2011-08-23 20:10:29:
这就是我为什么一直不喜欢菌落直接挑克隆pcr。先挑克隆到EP管中摇，摇的时候做一个阴性对照，用100-200ul培养基摇1个小时以上，然后再做PCR，多好。。。

摇菌一小时以上，这么短时间就能保证菌落长起来？
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8楼2011-08-24 09:09:18
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tonghust

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 南海所老龚 at 2011-08-24 09:09:18:
摇菌一小时以上，这么短时间就能保证菌落长起来？

对的，做PCR足够了。当然也要看你挑的克隆大小，你不放心也可摇2个小时啊。。。

最放心的方法是与空白对照比较，看到有点浑浊了就表明摇起来了。
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9楼2011-08-26 08:41:38
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!第一个MolEPI，恭喜！ 2011-08-26 11:27:17
分析以下几点：
1 通过挑取单菌落PCR验证，有目的条带，切条带较亮，应该说明前面的连接没有问题，没有连接成功菌落验证是不会出现特异条带的，何况普通的TA克隆连接效率还是挺高的。
2 PCR 使用的是通用引物还是特异性引物？
在排除杂菌污染情况下，通用引物一般不会扩增结果会有这么多非特异性扩增，如果楼主上图使用的是特异性引物，建议使用通用引物试试。如果是TA克隆，后面的测序也是使用M13进行测序的，如果M13通用引物扩增产生多条带，那测序也会有重叠锋出现，很难测序成功。
3 摇菌过程中，可以常观察，如果菌液先变浑浊，后逐渐变清，且有菌落碎片产生，应该是噬菌体污染了。
附个人TA克隆菌落PCR验证操作：
准备灭菌PCR管和无菌水，取10ul无菌水至PCR管中，枪头挑取菌落（DH5a,BL21）至PCR管中，吹打混匀。取3ul做PCR（25ul体系），剩余7ul菌落悬浮液，4度保存。PCR程序第一步预变性5min,PCR验证阳性克隆后，将剩余的7ul菌落悬浮液接种至相应抗性液体培养基中培养10-16h,用于菌液测序，提取质粒，菌种保存。
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
10楼2011-08-26 09:12:10
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