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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

MolEPI: 5
应助: 4 (幼儿园)
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专业: 人类遗传学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!第一个MolEPI，恭喜！ 2011-08-26 11:27:17

分析以下几点：
1 通过挑取单菌落PCR验证，有目的条带，切条带较亮，应该说明前面的连接没有问题，没有连接成功菌落验证是不会出现特异条带的，何况普通的TA克隆连接效率还是挺高的。
2 PCR 使用的是通用引物还是特异性引物？
在排除杂菌污染情况下，通用引物一般不会扩增结果会有这么多非特异性扩增，如果楼主上图使用的是特异性引物，建议使用通用引物试试。如果是TA克隆，后面的测序也是使用M13进行测序的，如果M13通用引物扩增产生多条带，那测序也会有重叠锋出现，很难测序成功。
3 摇菌过程中，可以常观察，如果菌液先变浑浊，后逐渐变清，且有菌落碎片产生，应该是噬菌体污染了。
附个人TA克隆菌落PCR验证操作：
准备灭菌PCR管和无菌水，取10ul无菌水至PCR管中，枪头挑取菌落（DH5a,BL21）至PCR管中，吹打混匀。取3ul做PCR（25ul体系），剩余7ul菌落悬浮液，4度保存。PCR程序第一步预变性5min,PCR验证阳性克隆后，将剩余的7ul菌落悬浮液接种至相应抗性液体培养基中培养10-16h,用于菌液测序，提取质粒，菌种保存。