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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!第一个MolEPI,恭喜! 2011-08-26 11:27:17
分析以下几点:
1 通过挑取单菌落PCR验证,有目的条带,切条带较亮,应该说明前面的连接没有问题,没有连接成功菌落验证是不会出现特异条带的,何况普通的TA克隆连接效率还是挺高的。
2 PCR 使用的是通用引物还是特异性引物?
在排除杂菌污染情况下,通用引物一般不会扩增结果会有这么多非特异性扩增,如果楼主上图使用的是特异性引物,建议使用通用引物试试。如果是TA克隆,后面的测序也是使用M13进行测序的,如果M13通用引物扩增产生多条带,那测序也会有重叠锋出现,很难测序成功。
3 摇菌过程中,可以常观察,如果菌液先变浑浊,后逐渐变清,且有菌落碎片产生,应该是噬菌体污染了。
附个人TA克隆菌落PCR验证操作:
准备灭菌PCR管和无菌水,取10ul无菌水至PCR管中,枪头挑取菌落(DH5a,BL21)至PCR管中,吹打混匀。取3ul做PCR(25ul体系),剩余7ul菌落悬浮液,4度保存。PCR程序第一步预变性5min,PCR验证阳性克隆后,将剩余的7ul菌落悬浮液接种至相应抗性液体培养基中培养10-16h,用于菌液测序,提取质粒,菌种保存。
不放弃,日子总有阳光,追求总有希望!
10楼2011-08-26 09:12:10
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