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南海所老龚

新虫 (正式写手)

[求助] TA克隆遇到的问题

各位晚上好，最近做克隆，一直做不出来，很是郁闷。希望各位虫子能够解疑。问题如下：
我克隆程序是涂板、菌落PCR检测、扩大培养。以下图片是我PCR检测的结果，最亮的带为目的片段（带虽然不是很亮很纯），接着220rpm，37摄氏度扩大培养，两天后都没长起来，什么原因？（PS:扩大培养用培养液与平板成分除前者未加琼脂粉之外其余均一致)
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1楼 2011-08-22 22:58:24
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-08-23 19:13:29
1.只是菌液PCR验证不一定完全可靠,没摇起来可能就是没连接成功，但一定确认抗性没有搞错或是抗生素没有出现问题。
2.设置个正对照，在同样条件下再做一次试试
3.确保你的PCR产物末端有加有A
4.胶图杂带太多了，提高退火温度试试。
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5楼2011-08-23 15:51:08
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wyzl2007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你这种情况从未遇到！！！单从图中看，你的PCR反应体系及程序是有问题的！！！
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2楼2011-08-23 08:58:17
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longage.gene

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
南海所老龚(金币+1): 因为PCR检测时，菌落已经比较大，放在4度冰箱，约2小时候扩大培养。 2011-08-23 14:30:02
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-08-23 19:13:13
1. 菌落pcr说明问题不严谨，只能作为没问题时的确认方法，
2. 你的primer在菌的基因中又没结合点，
3. 菌落pcr时，菌如何保存的？
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3楼2011-08-23 10:34:51
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wyzl2007 at 2011-08-23 08:58:17:
你这种情况从未遇到！！！单从图中看，你的PCR反应体系及程序是有问题的！！！

你好。PCR体系及程序问题出在哪里？这至多说明菌落不纯，导致结果出现多条带。
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
4楼2011-08-23 14:35:42
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