| 查看: 1712 | 回复: 4 | ||||
beisimai895木虫 (小有名气)
|
[交流]
【求助/交流】TA克隆为什么会长出蓝斑 已有4人参与
|
| 请教一个问题，TA克隆完蓝白筛，会长出蓝斑吗？T载体不是俩头都是A尾吗？应该不会自连吧，还有，T载体可做去磷酸化吗？ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 实验方法 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有98人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 虫子们有谁做过TA克隆呀？额想知道TA克隆的具体的实验步骤
已经有25人回复
- TA克隆遇到的问题
已经有10人回复
- TA克隆之疑问
已经有11人回复
- 【求助/交流】TA克隆
已经有15人回复
- 【求助/交流】PCR产物切胶回收后可不可以加A尾,做TA克隆，急！希望高手们能帮帮忙！
已经有9人回复
- 【求助/交流】大家做TA克隆、蓝白斑筛选用什么样的感受态细胞？
已经有20人回复
- 【求助/交流】求助TA克隆问题
已经有10人回复
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 7
- 应助: 1 (幼儿园)
- 贵宾: 0.021
- 金币: 7298.5
- 散金: 9
- 红花: 13
- 帖子: 4032
- 在线: 224.7小时
- 虫号: 551611
- 注册: 2008-04-27
- 性别: GG
- 专业: 神经系统肿瘤（含特殊感受
2楼2010-07-15 10:48:34
lwiaanngg
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 46 (小学生)
- 贵宾: 0.773
- 金币: 7403.2
- 散金: 24
- 红花: 12
- 帖子: 1211
- 在线: 110.3小时
- 虫号: 43541
- 注册: 2004-04-10
- 专业: 应用高分子化学与物理
3楼2010-07-15 11:41:51
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
|
本帖内容被屏蔽 |
4楼2010-07-15 11:44:01
ben1147
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 18 (小学生)
- 贵宾: 0.003
- 金币: 5847.6
- 红花: 6
- 帖子: 952
- 在线: 116.9小时
- 虫号: 709538
- 注册: 2009-02-26
- 专业: 微生物生理与生物化学
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-07-15 12:55:43
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-07-15 12:55:43
|
一种情况是单链突出的T容易降解，尤其T载体上是3'的突出末端，在没有分装，反复冻融的情况下容易发生。大家平时都认为出现蓝斑是因为这种载体自连，但是这种情况的发生要求两端T都降解才行，实际情况中只占很少一部分。 比较多的情况是买来的载体里面本身就有环状质粒，或者线状质粒末端本身就没有T而发生的自连，这两种都是T载体质量的问题 如果你看过T载体制备的过程的话，应该能理解这两种情况的出现。 T载体也是用一般的克隆载体制备的，先用平末端的酶切（常见的有Sma I或者Eco RV），然后再利用Taq的特性给两条链平末端的3'端加上T。大家都知道Taq酶在dNTP存在的情况下会给3'端加A，这个反应不需要模板。实际上Taq酶并不是只能加A，而是在四种核苷酸都存在的情况下倾向于加A。事实上如果体系里面只有dTTP的话，Taq酶也能加T。 因此T载体制备主要就是两个步骤，酶切和加T。 如果酶切不完全，体系里残留有没切开的超螺旋质粒，产物又没有切胶纯化的话，残留的野生质粒就会留在最终的产品里，转化到感受态里，形成蓝斑 如果加T不完全，就会有线性平末端、没有T的质粒残留，就会在连接体系中发生自连而产生蓝斑 如果用的是promega、takara之类大公司的T载体，这种情况还少一点。如果是国内公司的产品，质量真的不敢保证。 当然T载体的制备也有另一种方法（连接接头，Xcm I酶切）。但是根据现在的T载体T两端紧接的就是MCS来看，应该还是上面说的这种方法。 其实知道了方法，自己就可以做T载体，用不同的克隆载体做，pUC系列，pBluescript系列等等，甚至可以把表达载体做成T载体。我们实验室就是用的自己做的T载体，可以根据目的片段内部的酶切位点是否合适来选择不同的载体，比只有买来的一种载体方便多了。 |
5楼2010-07-15 12:14:06
10