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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因克隆中酶切连接问题
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zhjzhou

木虫 (著名写手)

[求助] 基因克隆中酶切连接问题

各位大侠好，我克隆一个2000bp左右的基因，一开始设计的引物没有加酶切位点，PCR产物直接连接到T-vector中，已经测序和我的目的基因完全吻合。于是又重新设计加上酶切位点的引物，从质粒上PCR，这样PCR产物纯化后可以直接连接到我要克隆的载体中，不需要酶切吧。我是这样做的，现在遇到问题了，我连接的产物转化老是长不出来。请各位指点下，我PCR产物和载体都需要酶切，再进行连接吗？我以前PCR产物没有酶切直接连接都可以的，现在不知道是怎么回事情了
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1楼 2012-02-20 12:36:47
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhjzhou(金币+1): 2012-02-21 10:37:53
你实验流程有问题，PCR产物（含有限制性酶切位点）和质粒载体应该分别用同样的限制性内切酶处理，在分别回收，然后再进行连接。建议你看看分子克隆表达这方面的文章。
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10楼2012-02-21 09:35:21
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merckten123

新虫 (初入文坛)
肯定需要酶切的啊，不酶切的话没有两者没有互补的粘性末端，应该不能连上的吧。。。。看你之前用的是T载体的，T载体是不需要的酶切的
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2楼2012-02-20 13:25:27
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhjzhou(金币+3): ★★★很有帮助 2012-02-20 19:45:53
如果引物中有保护碱基，第二次PCR后可以不连T载体，直接酶切后连同样酶切的表达载体，再转化。
你不酶切是连不上的，长不出来正常，长出来也是携带空载体或杂菌。
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3楼2012-02-20 17:00:29
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zhjzhou

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-02-20 17:00:29:
如果引物中有保护碱基，第二次PCR后可以不连T载体，直接酶切后连同样酶切的表达载体，再转化。
你不酶切是连不上的，长不出来正常，长出来也是携带空载体或杂菌。

是的，长出来的，我检测了都没有，真是浪费了不少时间
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4楼2012-02-20 19:45:05
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