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zhjzhou

木虫 (著名写手)

[求助] 基因克隆中酶切连接问题

各位大侠好,我克隆一个2000bp左右的基因,一开始设计的引物没有加酶切位点,PCR产物直接连接到T-vector中,已经测序和我的目的基因完全吻合。于是又重新设计加上酶切位点的引物,从质粒上PCR,这样PCR产物纯化后可以直接连接到我要克隆的载体中,不需要酶切吧。我是这样做的,现在遇到问题了,我连接的产物转化老是长不出来。请各位指点下,我PCR产物和载体都需要酶切,再进行连接吗?我以前PCR产物没有酶切直接连接都可以的,现在不知道是怎么回事情了
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
zhjzhou(金币+1): 2012-02-21 10:37:53
你实验流程有问题,PCR产物(含有限制性酶切位点)和质粒载体应该分别用同样的限制性内切酶处理,在分别回收,然后再进行连接。建议你看看分子克隆表达这方面的文章。
10楼2012-02-21 09:35:21
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merckten123

新虫 (初入文坛)

肯定需要酶切的啊,不酶切的话没有两者没有互补的粘性末端,应该不能连上的吧。。。。看你之前用的是T载体的,T载体是不需要的酶切的
2楼2012-02-20 13:25:27
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
zhjzhou(金币+3): ★★★很有帮助 2012-02-20 19:45:53
如果引物中有保护碱基,第二次PCR后可以不连T载体,直接酶切后连同样酶切的表达载体,再转化。
你不酶切是连不上的,长不出来正常,长出来也是携带空载体或杂菌。
3楼2012-02-20 17:00:29
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zhjzhou

木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-02-20 17:00:29:
如果引物中有保护碱基,第二次PCR后可以不连T载体,直接酶切后连同样酶切的表达载体,再转化。
你不酶切是连不上的,长不出来正常,长出来也是携带空载体或杂菌。

是的,长出来的,我检测了都没有,真是浪费了不少时间
4楼2012-02-20 19:45:05
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