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rainontime

新虫 (小有名气)

[求助] 求助 双酶切验证阳性克隆的问题

本人将某 2600bp的目的基因 和 pet28a载体 双酶切,切胶回收,T4连接酶4度过夜连接, 将10uL连接产物加到120uL感受态细胞中, 加入800uL无抗性培养基 摇菌50分钟, 涂平板10块,每块80uL, 过夜后,发现只长了一个菌落。。。挑取菌落培养,提取质粒,双酶切验证是否是阳性克隆,切成了两条片段,发现其中较短的那条片段比目的片段长!!!!!!!请问这是咋回事?谢谢!!!
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rainontime

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-01 19:59:14:
1:连接体系不知道你选择的合适不,涂布了那么多板子怎么就长了一个单克隆,个人觉得你先从连接体系上着手,提高了连接的效率才能保证你做一次连接的成功率啊,你说是不?连接体系你先得定量看看你的载体和目的基 ...

我在酶连之前跑过电泳了,质粒片段和目的基因片段亮度差不多。。。。。。。不知道怎么样才可以提高连接效率啊?
7楼2011-08-02 11:49:05
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duckcat

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

rainontime(金币+1): 不错的 2011-08-01 18:10:16
1949stone(MolEPI+1): 不错 不错 2011-08-01 20:31:33
这是很正常的,一般酶切后的目的片段往往比pcr扩增得到的跑胶拖后,主要有以下几个物理因素造成:
1,因为载体属于比较大的分子了,质粒如果浓度较高的话,难免分子间的作用力较强,因为这种力的存在导致了目的片段跑胶速度较慢!
2, 可能切得时间比较长,导致许多分子杂质增多!
3,如果很靠后的话极有可能你的凝胶浓度不均匀……

暂时想到这么多!
2楼2011-08-01 17:23:48
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rainontime

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by duckcat at 2011-08-01 17:23:48:
这是很正常的,一般酶切后的目的片段往往比pcr扩增得到的跑胶拖后,主要有以下几个物理因素造成:
1,因为载体属于比较大的分子了,质粒如果浓度较高的话,难免分子间的作用力较强,因为这种力的存在导致了目的片 ...

我用的是自己配的0.7%的胶,而且为了把条带拉开,跑了20分钟,因为片段比较大。。。。。。是不是这样也会导致位置偏移?谢谢!
3楼2011-08-01 18:08:50
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d1emon

铜虫 (初入文坛)


1949stone(金币+1): 有一定道理 2011-08-01 20:31:53
跑的时间有点短,这也有可能造成你说的情况
,pcr验证加酶切验证即可确定
4楼2011-08-01 19:17:22
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