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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 双酶切验证阳性克隆的问题
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duckcat

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

rainontime(金币+1): 不错的 2011-08-01 18:10:16
1949stone(MolEPI+1): 不错 不错 2011-08-01 20:31:33
这是很正常的，一般酶切后的目的片段往往比pcr扩增得到的跑胶拖后，主要有以下几个物理因素造成：
1，因为载体属于比较大的分子了，质粒如果浓度较高的话，难免分子间的作用力较强，因为这种力的存在导致了目的片段跑胶速度较慢！
2, 可能切得时间比较长，导致许多分子杂质增多！
3，如果很靠后的话极有可能你的凝胶浓度不均匀……

暂时想到这么多！
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2楼2011-08-01 17:23:48
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【答案】应助回帖

1949stone(MolEPI+1): 来也 2011-08-01 20:32:03
1：连接体系不知道你选择的合适不，涂布了那么多板子怎么就长了一个单克隆，个人觉得你先从连接体系上着手，提高了连接的效率才能保证你做一次连接的成功率啊，你说是不？连接体系你先得定量看看你的载体和目的基因的量，如果量差不多的话，目的基因多加一些；当然了你要确定你的载体和基因酶切完全了；
2：至于验证嘛，很简单的，先把长出来的单克隆划到相同抗性的板子上，然后做一个PCR初步验证看看，如果能够P出来大小相同的一条带那很有可能就对了，然后再提取质粒进行酶切验证就OK了。
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5楼2011-08-01 19:59:14
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