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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 单酶切，酶连之后验证问题
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

[求助] 单酶切，酶连之后验证问题

请教各位一个问题，因为智力上面没有合适的酶切位点，在质粒上面再加一个抗性基因的话需要设计一个单酶切酶连的位点，这个抗性基因很小，大概300左右bp，酶切验证的话跑胶的话会不是很清楚，请问可以做PCR验证吗？要是反接的话会不会也P出来目的基因？先谢过了！！
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上班族，学习ing……
1楼 2011-07-11 08:38:36
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-07-11 10:33:37:
加抗性基因的话  一定要注意抗性基因的启动子一起加进去，这样不管是正接还是反接  ，都可以用。
300BP的酶切  质粒多加一点，其实是可以看出来的，用2%的胶，应该没问题。
PCR验证的话，反着接也是可以P出来的。

话所上次问过之后就开始动手实验了，之前一直很好，后面T载体克隆后，单切连质粒的时候出现问题了，转化子老是不长，开始以为是没有连好，重复几次还是不行，后来又重新P了一下，然后连T载体后涂布了一个Kan的抗性板，结果没长，涂布Amp的平板长的很好，说明不是感受态的问题，按理说这个抗性加上起作用的话，连T载体也该长啊，这个会是什么原因呢？
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上班族，学习ing……
7楼2011-08-05 21:30:13
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhmdddd(金币+5): 知道了，十分感谢！ 2011-07-11 11:14:20
lstt09nk(金币+2): 感谢交流，欢迎常来 2011-07-17 20:40:54
加抗性基因的话  一定要注意抗性基因的启动子一起加进去，这样不管是正接还是反接  ，都可以用。
300BP的酶切  质粒多加一点，其实是可以看出来的，用2%的胶，应该没问题。
PCR验证的话，反着接也是可以P出来的。
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2楼2011-07-11 10:33:37
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ybs007

金虫 (小有名气)
★
adslye(金币+1): 鼓励新虫~~祝顺利！ 2011-08-06 07:57:54
我也是新手，我弱弱的问一下，会出现反接的问题么？质粒是环状的哦。。。
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平生我自知
3楼2011-07-16 20:34:47
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-08-06 07:58:36
引用回帖:
Originally posted by ybs007 at 2011-07-16 20:34:47:
我也是新手，我弱弱的问一下，会出现反接的问题么？质粒是环状的哦。。。

你是单酶切的话，质粒线性化，就不是你说的环状的了，切了后两端都是相同的酶切位点，你要连的目的基因两端也是相同的酶切位点，所以你的目的基因有可能是正着，按着它编码转录翻译的顺序接上去，也有可能是反着接上去，反着话后面是不表达的，所以单酶切要验证正反接的！不知道我说明白没有……
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上班族，学习ing……
4楼2011-07-17 12:11:02
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