| 查看: 1986 | 回复: 13 | |||
maxwell1988金虫 (小有名气)
|
[交流]
【求助/交流】关于酶切产物连接的一点问题 已有5人参与
|
|
最近在做重组基因的连接，但是连了好几次就是连不上。具体是这样的，希望高手帮忙答疑解惑下： 基因(~0.5kb)是单酶切，载体(~5kb)是双酶切，20μl体系，基因载体按摩尔比算的体积比： 基因 2μl 载体 9μl buffer 2μl PDG 2μl T4连接酶 5μl 22℃，16h。 之后就是常规的转化了，菌落PCR，单酶切鉴定后发现条带的大小不对，宣告连接失败。  要命的是做了好几次，甚至有次还做了基因载体比例的梯度连接实验，结果还是以失败告终。我想知道问题可能出在了什么地方，有什么地方可以改进的，望各位大侠们不比吝赐教！！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有214人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 基因克隆中酶切连接问题
已经有13人回复
- 单酶切连接的问题
已经有4人回复
- 连接酶切问题
已经有10人回复
- PCR ， 双酶切，连接问题
已经有17人回复
- 单酶切，酶连之后验证问题
已经有6人回复
- 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
已经有52人回复
- 【求助/交流】单酶切酶和DNA的比例，体系大小的问题
已经有14人回复
- 【求助/交流】质粒双酶切连接问题
已经有7人回复
- 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题
已经有10人回复
- 【求助/交流】酶切连接后的分子大小问题
已经有12人回复
zhwenxing
木虫 (著名写手)
尛森蟲
- 应助: 11 (小学生)
- 贵宾: 0.005
- 金币: 2189.8
- 散金: 50
- 红花: 2
- 帖子: 1324
- 在线: 93.3小时
- 虫号: 596551
- 注册: 2008-09-09
- 专业: 疫苗学
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+5):全面，细心 2010-11-19 10:44:48
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+5):全面，细心 2010-11-19 10:44:48
|
1、连接片段和载体的比例，不是按照ul来计算，是数量比，mol数！！！ 2、500bp的片段连接载体是不成问题的。关键在于：切出来的末端是否和载体的缺刻正好相对？ 3、不知道你的切点是平末端还是粘末端？前者是否需要脱磷处理，以提高连接效率？ 4、不知用的是哪个公司的产品，检查是否过期等。连接酶5uL？？？这是带buffer吗？如果不是，是不是浓度太高了？甘油就能够完全抑制活性了。 5、22℃连接16h是否太长了？我经常用到的是4℃，2天； 16℃，30-50min； 22℃，2-5h…… 6、建议按照说明书来做，做前仔细计算好体系，到底加多少！酶切的产物是否纯化了？纯化后溶解液是什么？是否检测浓度了？酶切后的载体是否存在自连？？ 多数以反问的形式回答楼主，希望能有帮助。 |
2楼2010-11-19 10:23:35
skkyy88888
铜虫 (著名写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 142
- 散金: 1521
- 红花: 1
- 沙发: 1
- 帖子: 2340
- 在线: 216.2小时
- 虫号: 277762
- 注册: 2006-09-09
- 专业: 生物化学
3楼2010-11-19 12:11:46
zgb1982
木虫 (正式写手)
- 应助: 46 (小学生)
- 金币: 2895.3
- 红花: 3
- 帖子: 536
- 在线: 227.2小时
- 虫号: 664342
- 注册: 2008-11-29
- 专业: 植物病理学
4楼2010-11-19 13:22:15
zhwenxing
木虫 (著名写手)
尛森蟲
- 应助: 11 (小学生)
- 贵宾: 0.005
- 金币: 2189.8
- 散金: 50
- 红花: 2
- 帖子: 1324
- 在线: 93.3小时
- 虫号: 596551
- 注册: 2008-09-09
- 专业: 疫苗学
5楼2010-11-19 17:51:02
maxwell1988
金虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1038.7
- 散金: 20
- 红花: 3
- 帖子: 103
- 在线: 35.2小时
- 虫号: 883233
- 注册: 2009-10-25
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
6楼2010-11-20 21:50:42
maxwell1988
金虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1038.7
- 散金: 20
- 红花: 3
- 帖子: 103
- 在线: 35.2小时
- 虫号: 883233
- 注册: 2009-10-25
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
7楼2010-11-20 21:53:46
maxwell1988
金虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1038.7
- 散金: 20
- 红花: 3
- 帖子: 103
- 在线: 35.2小时
- 虫号: 883233
- 注册: 2009-10-25
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
8楼2010-11-20 21:56:43
9楼2010-11-20 23:01:11
skkyy88888
铜虫 (著名写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 142
- 散金: 1521
- 红花: 1
- 沙发: 1
- 帖子: 2340
- 在线: 216.2小时
- 虫号: 277762
- 注册: 2006-09-09
- 专业: 生物化学
10楼2010-11-21 08:43:42
