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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做一个克隆所需的最短时间？比比谁更高效快速！
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shuihaizi

金虫 (小有名气)

[交流] 做一个克隆所需的最短时间？比比谁更高效快速！

克隆一个基因：
第一天：小体系PCR（上午）-大体系回收（下午）-小样酶切-大体系酶切回收（包括载体）（晚上）-连接
第二天：早晨转化-晚上摇菌
第三天：PCR鉴定和提质粒酶切鉴定（上午提，下午鉴定）
一切顺利的情况下，紧忙乎，有没有更快更更高效的体系啊？
求交流！
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1楼 2011-08-09 22:09:15
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邓远洪dyh

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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shuihaizi(金币+3): 2011-08-16 11:14:19
西瓜(金币+4): 这都是经验啊 2011-08-16 11:52:12
引用回帖:
22楼: Originally posted by shuihaizi at 2011-08-15 16:38:44:
PCR不摸条件直接就做，没有条带怎么办？
你用什么柱子回收只要10分钟啊？溶胶不得15分钟呢？
你连得是T载体吧？要是通过酶切位点那不得做酶切吗？
什么转化方法只要半小时？冰浴要30分钟，热激后摇就要30-45分 ...

PCR不一定要摸条件，其实连接至需要很少量的DNA分子就够了，在你跑胶的时候只需要有隐约的条带就够了，甚至更少的两都行。 转化只需要冰浴15分钟足够了，过后的摇菌只是让感受态菌恢复。时间长短没事。柱子直接用DNA胶回收柱就可以了。  从你说的条件也是T载体的要求啊。  如果是亚克隆，可以把回收后的PCR产物直接进行酶切处理，然后再过柱回收。载体片段也可以同样的方法。因为像几十bp的小片段，回收柱回收不回来。所以都可以直接用DNA回收柱直接回收。
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25楼2011-08-16 09:00:22
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cloverplm

金虫 (小有名气)
★
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shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:33:51
哎，一般都是这个样子的啦，公司效率会高一点，因为有很多机器，很多Items可以同时做。
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3楼2011-08-09 22:53:26
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wzqno

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:34:01
基本上最快也就这速度了，你可以用NEB的内切酶，一个小时搞定酶切，稍微快点
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4楼2011-08-10 10:45:23
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
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dhd997(金币+3): good 2011-08-10 12:12:02
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:34:40
原先在公司做的时候时间是这么安排的：
第一天：小体系PCR（上午）-大体系回收（下午）-小样酶切-大体系酶切回收（包括载体）（晚上）-连接转化
第二天：早上摇菌，1小时候菌落PCR验证，大概中午能出菌检结果，下午可以酶切验证或测序
fermentas的普通T4连接酶，我22℃连半个小时足够了，所以晚上连接转化可以一起做。
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6楼2011-08-10 11:37:07
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