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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做一个克隆所需的最短时间？比比谁更高效快速！
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shuihaizi

金虫 (小有名气)

[交流] 做一个克隆所需的最短时间？比比谁更高效快速！

克隆一个基因：
第一天：小体系PCR（上午）-大体系回收（下午）-小样酶切-大体系酶切回收（包括载体）（晚上）-连接
第二天：早晨转化-晚上摇菌
第三天：PCR鉴定和提质粒酶切鉴定（上午提，下午鉴定）
一切顺利的情况下，紧忙乎，有没有更快更更高效的体系啊？
求交流！
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1楼 2011-08-09 22:09:15
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+4): good 2011-08-16 11:52:27
shuihaizi(金币+2): 2011-08-23 16:18:42
另外IN FUSION，LIC等方法。连酶切连接一步都基本省掉了。更能节省时间。
看文献大规模高通量做构建的时候，均采用上述构建方法。
如果对PCR很有信心，是不是连切胶都可以省掉，直接过一遍PCR纯化柱。
另外现在的快速连接，5-10min搞定。、
最后质粒也不需要那么复杂，菌落PCR鉴定，甚至快检跑个电泳证明有插入基因。或者连鉴定都不鉴定（前提载体做得好）直接送测序，反正现在测序也便宜的很。
不过在学校的话，真是没有必要这么赶，认认真真老老实实，一步一步进行，做好对照，一次成功才是王道
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23楼2011-08-15 17:08:18
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cloverplm

金虫 (小有名气)
★
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shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:33:51
哎，一般都是这个样子的啦，公司效率会高一点，因为有很多机器，很多Items可以同时做。
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3楼2011-08-09 22:53:26
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wzqno

金虫 (小有名气)
★
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shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:34:01
基本上最快也就这速度了，你可以用NEB的内切酶，一个小时搞定酶切，稍微快点
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4楼2011-08-10 10:45:23
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
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dhd997(金币+3): good 2011-08-10 12:12:02
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:34:40
原先在公司做的时候时间是这么安排的：
第一天：小体系PCR（上午）-大体系回收（下午）-小样酶切-大体系酶切回收（包括载体）（晚上）-连接转化
第二天：早上摇菌，1小时候菌落PCR验证，大概中午能出菌检结果，下午可以酶切验证或测序
fermentas的普通T4连接酶，我22℃连半个小时足够了，所以晚上连接转化可以一起做。
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6楼2011-08-10 11:37:07
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