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shuihaizi

金虫 (小有名气)


[交流] 做一个克隆所需的最短时间?比比谁更高效快速!

克隆一个基因:
第一天:小体系PCR(上午)-大体系回收(下午)-小样酶切-大体系酶切回收(包括载体)(晚上)-连接
第二天:早晨转化-晚上摇菌
第三天:PCR鉴定和提质粒酶切鉴定(上午提,下午鉴定
一切顺利的情况下,紧忙乎,有没有更快更更高效的体系啊?
求交流!
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shuihaizi

金虫 (小有名气)


引用回帖:
21楼: Originally posted by 邓远洪dyh at 2011-08-15 15:13:18:
直接大体系PCR2小时,40分钟电泳检测,10分钟过柱回收PCR产物,40分钟回收产物检测,1小时连接(亚克隆连接时间适当加长)。半小时转化(亚克隆,冰浴时间适当延长),5分钟涂板,十小时挑斑于试管,八小时后提质 ...

PCR不摸条件直接就做,没有条带怎么办?
你用什么柱子回收只要10分钟啊?溶胶不得15分钟呢?
你连得是T载体吧?要是通过酶切位点那不得做酶切吗?
什么转化方法只要半小时?冰浴要30分钟,热激后摇就要30-45分钟。
请你详细介绍一下好吗?十分感谢!
22楼2011-08-15 16:38:44
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cloverplm

金虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:33:51
哎,一般都是这个样子的啦,公司效率会高一点,因为有很多机器,很多Items可以同时做。
3楼2011-08-09 22:53:26
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wzqno

金虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:34:01
基本上最快也就这速度了,你可以用NEB的内切酶,一个小时搞定酶切,稍微快点
4楼2011-08-10 10:45:23
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★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
dhd997(金币+3): good 2011-08-10 12:12:02
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:34:40
原先在公司做的时候时间是这么安排的:
第一天:小体系PCR(上午)-大体系回收(下午)-小样酶切-大体系酶切回收(包括载体)(晚上)-连接转化
第二天:早上摇菌,1小时候菌落PCR验证,大概中午能出菌检结果,下午可以酶切验证或测序
fermentas的普通T4连接酶,我22℃连半个小时足够了,所以晚上连接转化可以一起做。
6楼2011-08-10 11:37:07
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