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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做一个克隆所需的最短时间？比比谁更高效快速！
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shuihaizi

金虫 (小有名气)

[交流] 做一个克隆所需的最短时间？比比谁更高效快速！

克隆一个基因：
第一天：小体系PCR（上午）-大体系回收（下午）-小样酶切-大体系酶切回收（包括载体）（晚上）-连接
第二天：早晨转化-晚上摇菌
第三天：PCR鉴定和提质粒酶切鉴定（上午提，下午鉴定）
一切顺利的情况下，紧忙乎，有没有更快更更高效的体系啊？
求交流！
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1楼 2011-08-09 22:09:15
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 鼓励分享经验 2011-08-11 12:04:05
shuihaizi(金币+3): 2011-08-11 13:18:23
引用回帖:
11楼: Originally posted by shuihaizi at 2011-08-10 16:39:42:
你们用的是什么酶啊（PCR,连接酶）？用什么试剂盒回收啊？你说的菌落pcr能详细点吗？还是直接用1h的菌液就可以直接PCR了，体系是怎样的呢？

PCR 用pfu  或者PBO；连接酶用fermentas的T4连接酶，不过buffer我们公司自己配的，后来我试了一下他们公司带的buffer，也挺好用的；
菌落PCR就是先挑单菌落在200ml的培养基中摇菌1h，然后取2.5ul做PCR（30ul反应体系）
反应体系                    体积         
H2O                                     23 μl   
10 ×PCR缓冲液             3 μl  
正向引物 (50pmol/μl)           0.5 μl                           
反向引物 (50pmol/μl)           0.5μl      
DNTP (10mmol/L each)           0.3 μl         
菌液                       2.5 μl
Taq DNA聚合酶 (5U/μl)         0.2 μl                        
总体系                    30 μl
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14楼2011-08-10 19:34:51
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cloverplm

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:33:51
哎，一般都是这个样子的啦，公司效率会高一点，因为有很多机器，很多Items可以同时做。
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3楼2011-08-09 22:53:26
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wzqno

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:34:01
基本上最快也就这速度了，你可以用NEB的内切酶，一个小时搞定酶切，稍微快点
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-08-10 10:45:23
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+3): good 2011-08-10 12:12:02
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:34:40
原先在公司做的时候时间是这么安排的：
第一天：小体系PCR（上午）-大体系回收（下午）-小样酶切-大体系酶切回收（包括载体）（晚上）-连接转化
第二天：早上摇菌，1小时候菌落PCR验证，大概中午能出菌检结果，下午可以酶切验证或测序
fermentas的普通T4连接酶，我22℃连半个小时足够了，所以晚上连接转化可以一起做。
赞一下(3人) 回复此楼
6楼2011-08-10 11:37:07
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