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yoyoyoyo3985

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[求助] 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？

我的目标DNA现在是上到了T载体上，两端都加了酶切位点的。现在做的是将DNA双酶切回收，然后与双酶切回收的表达载体连接、转化。表达载体是有amp抗性的，可是做了几次，板子上都没有斑长出来。求各位大侠给予指点啊。
说明：酶切应该没问题的，因为胶回收的时候明显是分为两条带了，DNA的浓度也不错，感受态用空载体转化的生长状况也正常，难道是T4连接酶的问题吗？
我用的酶说明上是22度10min-1h。我都是连了数小时

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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过

1楼2011-05-10 09:24:08

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T.Shen

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【答案】应助回帖

yoyoyoyo3985(金币+1): 谢谢 2011-05-10 11:54:37
silicare(EPI+1): 2011-05-10 13:32:41

1：首先你要确定你酶切的载体和酶切的基因是完全酶切的，没有任何问题；
2：其次连接的温度和时间问题还有体系的选择，一般基因比载体多一些。。。
3：转化涂布时候抗生素呢？有没有问题，浓度对吗？筛选标记呢？
总之，出现问题了，要想想每一步的操作。。。
如果同样的体系做了好多次没有结果，就换体系。。。
祝好运！