应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 载体连接pcr片段一直连不上
51/1返回列表
查看: 4108  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)

[交流] 载体连接pcr片段一直连不上

我用nde1和xba1双酶切后的载体片段pLSB2（约4.5kb）分别与两个pcr片段做连接，然后做转化，整个实验全部都重新做了一遍，可一直连不上。请那位达人指点一下 ,衷心地表示谢谢！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生物学实验问题

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-09-25 10:50:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

清风寨

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-09-26 09:16:46
蓝绿精灵(金币+5): 非常感谢你即使的建议，我再试试 2011-09-27 09:29:21
首先连接时目的片段和酶切后质粒的摩尔量最好是1：1左右（可通过回收后跑胶 观看亮度大致判断一下 ） 转化时将连接产物加入感受态后30min不要动它 热激90s后放置冰上2min使其冷却 这些都是必须的步骤且不能有错 涂布板子时像你这种基本不长的 可以不进行涂布 直接将恢复1h后的菌液到于平板上晃匀 然后在超净台中开盖吹干 再进行培养 还有就是你可以选用转化效率高的超级感受态 你在鉴定时也不推荐你先抽质粒鉴定 可以做菌落PCR鉴定挑出阳性克隆再挑
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-09-26 09:07:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

清风寨

银虫 (小有名气)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-09-25 12:41:10
是你转化后涂布的板子没有长呢 还是挑出来的单菌落没有目的基因呢  你用的什么方法鉴定阳性克隆的  PCR 还是直接抽质粒鉴定 可能原因很多 具体情况说出来可以帮你想想
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-09-25 11:13:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)
谢谢了  我说说最近的两次实验情况吧，之前是转化（无论是热转还是电转）后平板上都未有菌落生长。经重新酶切质粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr扩增后酶切回收，前一次对照组（pLSB2）和实验组平板上都有菌落生长，实验组经划线培养，然后液体培养提质粒未发现有质粒，确定为假阳性。这一次一个实验组（连的2.6kb pcr片段）平板上有菌落生长，只是不多（几个的样子），经划线培养，然后液体培养提质粒单酶切鉴定，发现多切除一条带来，不知道是否有阳性转化子存在。
赞一下 回复此楼
3楼2011-09-25 21:05:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tianhuijuan

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-25 21:05:35:
谢谢了  我说说最近的两次实验情况吧，之前是转化（无论是热转还是电转）后平板上都未有菌落生长。经重新酶切质粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr扩增后酶切回收，前一次对照组（pLSB2）和实验组平板 ...

楼上的意思是引物出问题的可能性也很大？偶最近也是做这部分好长时间了，长不出菌落。。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-09-26 16:15:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭