应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 载体连接pcr片段一直连不上
181/1返回列表
查看: 3434  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)

[交流] 载体连接pcr片段一直连不上

我用nde1和xba1双酶切后的载体片段pLSB2（约4.5kb）分别与两个pcr片段做连接，然后做转化，整个实验全部都重新做了一遍，可一直连不上。请那位达人指点一下 ,衷心地表示谢谢！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生物学实验问题

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-09-25 10:50:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

清风寨

银虫 (小有名气)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-09-25 12:41:10
是你转化后涂布的板子没有长呢 还是挑出来的单菌落没有目的基因呢  你用的什么方法鉴定阳性克隆的  PCR 还是直接抽质粒鉴定 可能原因很多 具体情况说出来可以帮你想想
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-09-25 11:13:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)
谢谢了  我说说最近的两次实验情况吧，之前是转化（无论是热转还是电转）后平板上都未有菌落生长。经重新酶切质粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr扩增后酶切回收，前一次对照组（pLSB2）和实验组平板上都有菌落生长，实验组经划线培养，然后液体培养提质粒未发现有质粒，确定为假阳性。这一次一个实验组（连的2.6kb pcr片段）平板上有菌落生长，只是不多（几个的样子），经划线培养，然后液体培养提质粒单酶切鉴定，发现多切除一条带来，不知道是否有阳性转化子存在。
赞一下 回复此楼
3楼2011-09-25 21:05:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

清风寨

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-09-26 09:16:46
蓝绿精灵(金币+5): 非常感谢你即使的建议，我再试试 2011-09-27 09:29:21
首先连接时目的片段和酶切后质粒的摩尔量最好是1：1左右（可通过回收后跑胶 观看亮度大致判断一下 ） 转化时将连接产物加入感受态后30min不要动它 热激90s后放置冰上2min使其冷却 这些都是必须的步骤且不能有错 涂布板子时像你这种基本不长的 可以不进行涂布 直接将恢复1h后的菌液到于平板上晃匀 然后在超净台中开盖吹干 再进行培养 还有就是你可以选用转化效率高的超级感受态 你在鉴定时也不推荐你先抽质粒鉴定 可以做菌落PCR鉴定挑出阳性克隆再挑
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-09-26 09:07:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tianhuijuan

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-25 21:05:35:
谢谢了  我说说最近的两次实验情况吧，之前是转化（无论是热转还是电转）后平板上都未有菌落生长。经重新酶切质粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr扩增后酶切回收，前一次对照组（pLSB2）和实验组平板 ...

楼上的意思是引物出问题的可能性也很大？偶最近也是做这部分好长时间了，长不出菌落。。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-09-26 16:15:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lsp1018

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lstt09nk(金币+3): 鼓励交流，欢迎常来 2011-09-27 16:41:59
提供楼主两种方法：
1.可以换一株相近的宿主菌试试，如果新换的宿主菌中有阳性克隆，只能再换个质粒做载体转入到你的目的菌中。
2.PCR产物直接酶切，有时候可靠性不高。上次实验中也出现与楼主相似情况，长出来的全是假阳性。将PCR产物通过ta克隆连接到T载后，挑阳性克隆，胶回收酶切片段后，再与目的质粒连接就解决问题了。

祝好运！
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2011-09-26 16:35:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

muyanshuang

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
应该是菌株有污染，尽快更换感受态！
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2011-09-26 16:38:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fearlessman

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
从头检查一遍实验，包括酶切位点什么的，片段比较大的就是比较难连，建议转化时加点质粒对照，我的经验是转化不行就适当增大载体量，连接不行就增加片段量
赞一下(2人) 回复此楼
8楼2011-09-26 20:31:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lsp1018 at 2011-09-26 16:35:27:
提供楼主两种方法：
1.可以换一株相近的宿主菌试试，如果新换的宿主菌中有阳性克隆，只能再换个质粒做载体转入到你的目的菌中。
2.PCR产物直接酶切，有时候可靠性不高。上次实验中也出现与楼主相似情况，长出来 ...

谢谢  我要连接的两个PCR片段一个是2.7kb,一个是7.8kb。之前我将7.8kb pcr片段连T载体，可一直都连不上，考虑到该片段是不是太大了，所以就放弃做ta克隆了
赞一下 回复此楼
9楼2011-09-27 09:15:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 清风寨 at 2011-09-26 09:07:34:
首先连接时目的片段和酶切后质粒的摩尔量最好是1：1左右（可通过回收后跑胶 观看亮度大致判断一下 ） 转化时将连接产物加入感受态后30min不要动它 热激90s后放置冰上2min使其冷却 这些都是必须的步骤且不能有错 涂 ...

我要连接的一个pcr片段有7.8kb,是不是做电转化效率要高一些
赞一下 回复此楼
10楼2011-09-27 09:27:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lsp1018

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
adslye(金币+2): 感谢交流~~ 2011-09-28 11:28:19
引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-27 09:15:37:
谢谢  我要连接的两个PCR片段一个是2.7kb,一个是7.8kb。之前我将7.8kb pcr片段连T载体，可一直都连不上，考虑到该片段是不是太大了，所以就放弃做ta克隆了

TA克隆的效率非常高，如果说TA克隆连不上，通过酶切连接成功的可能性更低。
顺便请教一下7.8kb的片断是通过哪种DNA聚合酶克隆的？
赞一下(2人) 回复此楼
11楼2011-09-27 13:42:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tian1203

银虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
个人观点：2.0kb以上的片段不要用自己做的感受态，DH5也不好用。买JM109试试
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2011-09-27 18:18:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lsp1018 at 2011-09-27 13:42:41:
TA克隆的效率非常高，如果说TA克隆连不上，通过酶切连接成功的可能性更低。
顺便请教一下7.8kb的片断是通过哪种DNA聚合酶克隆的？

宝生物 la taq 聚合酶
赞一下 回复此楼
13楼2011-09-28 10:50:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lsp1018

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-28 10:50:34:
宝生物 la taq 聚合酶

奥，谢谢
回复此楼
14楼2011-09-28 18:28:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1899248楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-27 09:15:37
谢谢  我要连接的两个PCR片段一个是2.7kb,一个是7.8kb。之前我将7.8kb pcr片段连T载体，可一直都连不上，考虑到该片段是不是太大了，所以就放弃做ta克隆了...

其实7.8的连T载体貌似应该好连一些。。。
赞一下 回复此楼
15楼2012-11-28 15:17:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
1899988楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-27 09:27:48
我要连接的一个pcr片段有7.8kb,是不是做电转化效率要高一些...

其实我觉得可以换换感受态试试，有的时候并不是你连接产物的问题
赞一下 回复此楼
16楼2012-11-28 15:18:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

迷糊虫

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
同遇到这种问题，双酶切都能切开，但是做连接就连不上，连个假阳性的都没有，困扰好久了，求问LZ这个问题最后是怎么解决得啊？
赞一下 回复此楼
17楼2016-01-26 13:57:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lichee313

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by 迷糊虫 at 2016-01-26 13:57:24
同遇到这种问题，双酶切都能切开，但是做连接就连不上，连个假阳性的都没有，困扰好久了，求问LZ这个问题最后是怎么解决得啊？

感受态细胞效价不高的问题，换个好点的感受态
赞一下 回复此楼
18楼2018-10-12 14:42:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 蓝绿精灵 的主题更新
181/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂院校信息 +4 CX 330 2026-03-21 4/200 2026-03-21 23:48 by ms629
[考研] 326求调剂 +4 mlpqaz03 2026-03-15 4/200 2026-03-21 19:10 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +4 要好好无聊 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:57 by 学员8dgXkO
[考研] 【考研调剂】化学专业 281分，一志愿四川大学，诚心求调剂 +11 吃吃吃才有意义 2026-03-19 11/550 2026-03-21 18:23 by 学员8dgXkO
[考研] 298求调剂 +4 上岸6666@ 2026-03-20 4/200 2026-03-21 17:14 by 学员8dgXkO
[考研] 一志愿重庆大学085700资源与环境专硕，总分308求调剂 +3 墨墨漠 2026-03-18 3/150 2026-03-21 00:39 by JourneyLucky
[考研] 295求调剂 +4 一志愿京区211 2026-03-18 6/300 2026-03-20 23:41 by JourneyLucky
[考研] A区线材料学调剂 +5 周周无极 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:33 by laoshidan
[考研] 一志愿华中农业071010，总分320求调剂 +3 困困困困坤坤 2026-03-20 3/150 2026-03-20 20:38 by 学员8dgXkO
[考研] 353求调剂 +3 拉钩不许变 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:56 by JourneyLucky
[考研] 工科材料085601 279求调剂 +7 困于星晨 2026-03-17 9/450 2026-03-20 17:38 by 无懈可击111
[考研] 材料学硕318求调剂 +5 February_Feb 2026-03-19 5/250 2026-03-19 23:51 by 23Postgrad
[考研] 320求调剂0856 +3 不想起名字112 2026-03-19 3/150 2026-03-19 22:53 by 学员8dgXkO
[考博] 申博26年 +3 八6八68 2026-03-19 3/150 2026-03-19 19:43 by nxgogo
[考研] 一志愿985，本科211，0817化学工程与技术319求调剂 +10 Liwangman 2026-03-15 10/500 2026-03-19 10:25 by 无际的草原
[考研] 0703化学调剂 +3 妮妮ninicgb 2026-03-17 3/150 2026-03-18 10:29 by macy2011
[考研] 生物学071000 329分求调剂 +3 我爱生物生物爱� 2026-03-17 3/150 2026-03-18 10:12 by macy2011
[考研] 材料专硕326求调剂 +6 墨煜姒莘 2026-03-15 7/350 2026-03-17 17:10 by ruiyingmiao
[考研] 材料工程专硕274一志愿211求调剂 +6 薛云鹏 2026-03-15 6/300 2026-03-17 11:05 by 学员h26Tkc
[考研] 0856专硕279求调剂 +5 加油加油！? 2026-03-15 5/250 2026-03-15 11:58 by 2020015
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭