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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 载体连接pcr片段一直连不上
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蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)

[交流] 载体连接pcr片段一直连不上

我用nde1和xba1双酶切后的载体片段pLSB2（约4.5kb）分别与两个pcr片段做连接，然后做转化，整个实验全部都重新做了一遍，可一直连不上。请那位达人指点一下 ,衷心地表示谢谢！
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1楼2011-09-25 10:50:08
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lsp1018

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lstt09nk(金币+3): 鼓励交流，欢迎常来 2011-09-27 16:41:59
提供楼主两种方法：
1.可以换一株相近的宿主菌试试，如果新换的宿主菌中有阳性克隆，只能再换个质粒做载体转入到你的目的菌中。
2.PCR产物直接酶切，有时候可靠性不高。上次实验中也出现与楼主相似情况，长出来的全是假阳性。将PCR产物通过ta克隆连接到T载后，挑阳性克隆，胶回收酶切片段后，再与目的质粒连接就解决问题了。

祝好运！
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6楼2011-09-26 16:35:27
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lsp1018

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
adslye(金币+2): 感谢交流~~ 2011-09-28 11:28:19
引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-27 09:15:37:
谢谢  我要连接的两个PCR片段一个是2.7kb,一个是7.8kb。之前我将7.8kb pcr片段连T载体，可一直都连不上，考虑到该片段是不是太大了，所以就放弃做ta克隆了

TA克隆的效率非常高，如果说TA克隆连不上，通过酶切连接成功的可能性更低。
顺便请教一下7.8kb的片断是通过哪种DNA聚合酶克隆的？
赞一下(2人) 回复此楼
11楼2011-09-27 13:42:41
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lsp1018

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-28 10:50:34:
宝生物 la taq 聚合酶

奥，谢谢
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14楼2011-09-28 18:28:50
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