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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 载体连接pcr片段一直连不上
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蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)

[交流] 载体连接pcr片段一直连不上

我用nde1和xba1双酶切后的载体片段pLSB2（约4.5kb）分别与两个pcr片段做连接，然后做转化，整个实验全部都重新做了一遍，可一直连不上。请那位达人指点一下 ,衷心地表示谢谢！
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1楼2011-09-25 10:50:08
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lsp1018

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
adslye(金币+2): 感谢交流~~ 2011-09-28 11:28:19
引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-27 09:15:37:
谢谢  我要连接的两个PCR片段一个是2.7kb,一个是7.8kb。之前我将7.8kb pcr片段连T载体，可一直都连不上，考虑到该片段是不是太大了，所以就放弃做ta克隆了

TA克隆的效率非常高，如果说TA克隆连不上，通过酶切连接成功的可能性更低。
顺便请教一下7.8kb的片断是通过哪种DNA聚合酶克隆的？
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11楼2011-09-27 13:42:41
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清风寨

银虫 (小有名气)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-09-25 12:41:10
是你转化后涂布的板子没有长呢 还是挑出来的单菌落没有目的基因呢  你用的什么方法鉴定阳性克隆的  PCR 还是直接抽质粒鉴定 可能原因很多 具体情况说出来可以帮你想想
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2楼2011-09-25 11:13:42
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蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)
谢谢了  我说说最近的两次实验情况吧，之前是转化（无论是热转还是电转）后平板上都未有菌落生长。经重新酶切质粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr扩增后酶切回收，前一次对照组（pLSB2）和实验组平板上都有菌落生长，实验组经划线培养，然后液体培养提质粒未发现有质粒，确定为假阳性。这一次一个实验组（连的2.6kb pcr片段）平板上有菌落生长，只是不多（几个的样子），经划线培养，然后液体培养提质粒单酶切鉴定，发现多切除一条带来，不知道是否有阳性转化子存在。
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3楼2011-09-25 21:05:35
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清风寨

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-09-26 09:16:46
蓝绿精灵(金币+5): 非常感谢你即使的建议，我再试试 2011-09-27 09:29:21
首先连接时目的片段和酶切后质粒的摩尔量最好是1：1左右（可通过回收后跑胶 观看亮度大致判断一下 ） 转化时将连接产物加入感受态后30min不要动它 热激90s后放置冰上2min使其冷却 这些都是必须的步骤且不能有错 涂布板子时像你这种基本不长的 可以不进行涂布 直接将恢复1h后的菌液到于平板上晃匀 然后在超净台中开盖吹干 再进行培养 还有就是你可以选用转化效率高的超级感受态 你在鉴定时也不推荐你先抽质粒鉴定 可以做菌落PCR鉴定挑出阳性克隆再挑
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4楼2011-09-26 09:07:34
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