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汕头大学海洋科学接受调剂
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蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)


[交流] 载体连接pcr片段一直连不上

我用nde1和xba1双酶切后的载体片段pLSB2(约4.5kb)分别与两个pcr片段做连接,然后做转化,整个实验全部都重新做了一遍,可一直连不上。请那位达人指点一下 ,衷心地表示谢谢!
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fearlessman

新虫 (初入文坛)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
从头检查一遍实验,包括酶切位点什么的,片段比较大的就是比较难连,建议转化时加点质粒对照,我的经验是转化不行就适当增大载体量,连接不行就增加片段量
8楼2011-09-26 20:31:04
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清风寨

银虫 (小有名气)


★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-09-25 12:41:10
是你转化后涂布的板子没有长呢 还是挑出来的单菌落没有目的基因呢  你用的什么方法鉴定阳性克隆的  PCR 还是直接抽质粒鉴定 可能原因很多 具体情况说出来可以帮你想想
2楼2011-09-25 11:13:42
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蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)


谢谢了  我说说最近的两次实验情况吧,之前是转化(无论是热转还是电转)后平板上都未有菌落生长。经重新酶切质粒然后回收,重新找引物合成公司合成引物重新pcr扩增后酶切回收,前一次对照组(pLSB2)和实验组平板上都有菌落生长,实验组经划线培养,然后液体培养提质粒未发现有质粒,确定为假阳性。这一次一个实验组(连的2.6kb pcr片段)平板上有菌落生长,只是不多(几个的样子),经划线培养,然后液体培养提质粒单酶切鉴定,发现多切除一条带来,不知道是否有阳性转化子存在。
3楼2011-09-25 21:05:35
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清风寨

银虫 (小有名气)


★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利! 2011-09-26 09:16:46
蓝绿精灵(金币+5): 非常感谢你即使的建议,我再试试 2011-09-27 09:29:21
首先连接时目的片段和酶切后质粒的摩尔量最好是1:1左右(可通过回收后跑胶 观看亮度大致判断一下 ) 转化时将连接产物加入感受态后30min不要动它 热激90s后放置冰上2min使其冷却 这些都是必须的步骤且不能有错 涂布板子时像你这种基本不长的 可以不进行涂布 直接将恢复1h后的菌液到于平板上晃匀 然后在超净台中开盖吹干 再进行培养 还有就是你可以选用转化效率高的超级感受态 你在鉴定时也不推荐你先抽质粒鉴定 可以做菌落PCR鉴定挑出阳性克隆再挑
4楼2011-09-26 09:07:34
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