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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 兼并引物PCR连T载体后，怎么鉴定有没有连上
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yf-deng

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by maggie3277 at 2011-07-22 08:56:27:
用T载体上的通用引物扩增下，看看pcr得到的片段大小，不就ok？

简单实用！！
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11楼2011-07-22 09:36:20
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 学习了！ 2011-07-22 11:56:58
关于没连上的问题：
（1）确定你扩增片段时是用的Taq酶而不是高保真的pfu之类的酶，原因你懂得
（2）PCR片段扩完后一定要割胶回收后再拿去做连接
（3）如果连转做的不熟的话建议看一下我在小木虫上发的帖子http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683
关于酶切位点的问题：你酶切的目的是把T载体切成线性，跑胶看大小？难道你不知道T载体本身就是线性的！如果你做TA克隆的时候也把载体切完后用过的我就明白你为什么连转不成功了（T载体是直接可以拿来用的！）
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12楼2011-07-22 10:37:01
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wenjuan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-07-22 17:03:19
跑电泳应该是最简单的方法了，连接上的目的片段的载体与空载体一起跑，看两者大小是否有区别。要是还是不放心的话，可以在连接目的片段位点附近上下游找载体上的两个酶切位点，双酶切后跑电泳，看是否有你要的目的片段。最后祝你成功！
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13楼2011-07-22 14:26:15
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-22 10:37:01:
关于没连上的问题：
（1）确定你扩增片段时是用的Taq酶而不是高保真的pfu之类的酶，原因你懂得
（2）PCR片段扩完后一定要割胶回收后再拿去做连接
（3）如果连转做的不熟的话建议看一下我在小木虫上发的帖子[ur ...

PCR产物是一条带，T载体也是一条带，连接成功的是另一条带。T载体肯定是线性的，也有带，但是跑胶的时候与连接成功的产物不一定重合。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
14楼2011-07-22 18:30:05
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
至于跑胶要多少，得取决于样品有多少，但至少在电泳的时候5纳克看起来是很清楚的。
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15楼2011-07-22 18:33:01
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
1949stone(金币+1): 继续鼓励 2011-07-23 01:37:56
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-22 18:33:01:
至于跑胶要多少，得取决于样品有多少，但至少在电泳的时候5纳克看起来是很清楚的。

5ng是不是能看清楚要看EB是什么时候加的以及条带的大小，如果EB是在配胶的时候加进去的，那么在跑电泳的时候，EB的泳动方向与DNA泳动方向是相反的，如果条带比较小的话，5ng的量是不容易看清楚的。mark最亮的一条带一般是20ng/ul，其余的是10ng/ul,可以自己想象一下，如果mark上样量是1ul的话，一般的带是10ng的量，最小的那条带是不是很弱？
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16楼2011-07-22 20:17:07
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 替代染料是啥啊 2011-07-23 01:37:33
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-22 20:17:07:
5ng是不是能看清楚要看EB是什么时候加的以及条带的大小，如果EB是在配胶的时候加进去的，那么在跑电泳的时候，EB的泳动方向与DNA泳动方向是相反的，如果条带比较小的话，5ng的量是不容易看清楚的。mark最亮的一 ...

EB是有毒物质，我们实验室从不把它加到电泳槽里，只设置专门的染缸来染色，染缸放置在黑暗密闭处。建议你也别把EB放在开放的地方。

条带的大小跟显影亮度无关，有关的只是含量。即使条带很大，达到10kb，含量很少，亮度也不大。即使条带只有1kb，但是含量够多，亮度也会较大。所以，EB染色时候是ng（纳克）决定亮度，不是kb（片段长度）。

DNA Ladder的生产厂家是不同的，生产的条带也有一些区别。你说“mark最亮的一条带一般是20ng/ul”，但是我看到的说明书上写的是“23%”，用的是百分比，意思是这一条带占所有的条带总和的含量。是相对含量，而不是绝对含量。绝对含量是可以计算出来的，我们实验室的1kb DNA Ladder内DNA浓度是25ng/ul，每次电泳取4ul，那么最亮的一条带就是23ng。

现在我们实验室已经不用EB，换用替代染料了，这个替代染料是大势所趋。
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17楼2011-07-22 21:43:28
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1949stone: 我要把你的和冼亮淀粉酶 整理下 发个帖子 2011-07-23 01:38:28
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-22 21:43:28:
EB是有毒物质，我们实验室从不把它加到电泳槽里，只设置专门的染缸来染色，染缸放置在黑暗密闭处。建议你也别把EB放在开放的地方。

条带的大小跟显影亮度无关，有关的只是含量。即使条带很大，达到10kb，含 ...

理论上讲条带亮度是跟质量（比如几ng）成线性关系的，这一点是毋庸置疑的，但是由于EB的泳动结果使EB在胶中的含量成递减的状态，所以实际结果是由此而显得越靠近点样孔的地方越亮，如果你是个细心的人，从mark的条带能看出区别的（mark中有一条最的带，其余的带的质量都相同）

还有冼亮淀粉酶朋友给你的解释很专业，我也看了之后很有收获！
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18楼2011-07-22 23:06:23
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
EB有毒，最好单独染，密闭避光。也不用考虑电泳时迁移的问题了。
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19楼2011-07-22 23:11:34
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gwbk

木虫 (正式写手)
唉，我们实验室都是用SybrGreen和GelRed了，我配置的十几管Sybrgreen还在冰箱里闲着呢，电泳效果不理想，没有EB跑的好，都是用来发文章专利的，为了好的结果，忍了，认了。

有没有好一点的染料？
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20楼2011-07-24 02:16:28
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