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新虫 (初入文坛)

[求助] 兼并引物PCR连T载体后,怎么鉴定有没有连上

我用简并引物扩一段未知序列,扩出来后连T载体,怎么鉴定有没有连上呢,不能用简并引物去扩吧,酶切的话不知道目的序列的酶切位点情况,只能选几个试试 ,但效果都不理想啊,这一时半会也不知上哪去找通用引物,怎么办呢,急!
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


1949stone(金币+1): 继续鼓励 2011-07-23 01:37:56
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-22 18:33:01:
至于跑胶要多少,得取决于样品有多少,但至少在电泳的时候5纳克看起来是很清楚的。

5ng是不是能看清楚要看EB是什么时候加的以及条带的大小,如果EB是在配胶的时候加进去的,那么在跑电泳的时候,EB的泳动方向与DNA泳动方向是相反的,如果条带比较小的话,5ng的量是不容易看清楚的。mark最亮的一条带一般是20ng/ul,其余的是10ng/ul,可以自己想象一下,如果mark上样量是1ul的话,一般的带是10ng的量,最小的那条带是不是很弱?
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
16楼2011-07-22 20:17:07
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-07-22 08:18:15
试着跑一个电泳,PCR产物是一条带,T载体也是一条带,连接成功的是另一条带,但是要求DNA较多,连接体系不至于跑了电泳就用完了。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-07-22 07:28:06
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-07-22 11:55:04
可以用引物扩增一下试试;
当然了,序列你既然都知道,何不找一个合适的酶切位点呢?酶切验证一下即可。
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-07-22 08:25:50
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶


西瓜(金币+1): 鼓励 2011-07-22 11:55:16
目的序列的酶切位点可以用软件查找的
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-07-22 08:34:49
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