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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 兼并引物PCR连T载体后，怎么鉴定有没有连上
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 学习了！ 2011-07-22 11:56:58
关于没连上的问题：
（1）确定你扩增片段时是用的Taq酶而不是高保真的pfu之类的酶，原因你懂得
（2）PCR片段扩完后一定要割胶回收后再拿去做连接
（3）如果连转做的不熟的话建议看一下我在小木虫上发的帖子http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683
关于酶切位点的问题：你酶切的目的是把T载体切成线性，跑胶看大小？难道你不知道T载体本身就是线性的！如果你做TA克隆的时候也把载体切完后用过的我就明白你为什么连转不成功了（T载体是直接可以拿来用的！）
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
12楼2011-07-22 10:37:01
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【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 替代染料是啥啊 2011-07-23 01:37:33
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-22 20:17:07:
5ng是不是能看清楚要看EB是什么时候加的以及条带的大小，如果EB是在配胶的时候加进去的，那么在跑电泳的时候，EB的泳动方向与DNA泳动方向是相反的，如果条带比较小的话，5ng的量是不容易看清楚的。mark最亮的一 ...

EB是有毒物质，我们实验室从不把它加到电泳槽里，只设置专门的染缸来染色，染缸放置在黑暗密闭处。建议你也别把EB放在开放的地方。

条带的大小跟显影亮度无关，有关的只是含量。即使条带很大，达到10kb，含量很少，亮度也不大。即使条带只有1kb，但是含量够多，亮度也会较大。所以，EB染色时候是ng（纳克）决定亮度，不是kb（片段长度）。

DNA Ladder的生产厂家是不同的，生产的条带也有一些区别。你说“mark最亮的一条带一般是20ng/ul”，但是我看到的说明书上写的是“23%”，用的是百分比，意思是这一条带占所有的条带总和的含量。是相对含量，而不是绝对含量。绝对含量是可以计算出来的，我们实验室的1kb DNA Ladder内DNA浓度是25ng/ul，每次电泳取4ul，那么最亮的一条带就是23ng。

现在我们实验室已经不用EB，换用替代染料了，这个替代染料是大势所趋。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
17楼2011-07-22 21:43:28
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